骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與納米再生蜘蛛絲生物相容性及向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化關(guān)鍵點(diǎn)研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓中的非造血干細(xì)胞，能夠自我更新和多向分化。在不同的誘導(dǎo)條件下可以分化為多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有取材方便，對機(jī)體損傷小，體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，選用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行組織再生或移植，不僅沒有移植排異反應(yīng)，還避免了倫理紛爭。因此，對骨髓間充質(zhì)干

2、細(xì)胞的研究成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也被認(rèn)為是最有前途的組織工程的種子細(xì)胞。 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 為了建立一個(gè)有效的分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增的方法，我們采用Percoll淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行不連續(xù)密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs，實(shí)現(xiàn)在較短的時(shí)間內(nèi)體外擴(kuò)增和純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。免疫組織細(xì)胞化學(xué)檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原，結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD106，不表達(dá)CD34、CD4

3、5。 2.納米再生蜘蛛絲與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性研究 為了研究納米再生蜘蛛絲（SHSH）與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）之間的生物相容性，我們將BMSCs培養(yǎng)在SHSH和多聚賴氨酸（PLL）上。通過死活試劑染色我們對培養(yǎng)在SHSH上24 h、48h、72h后的BMSCs進(jìn)行存活分析；同時(shí)以BrdU作為標(biāo)記物，觀察這些細(xì)胞在0-24 h、24-48 h和48-72 h的增殖狀況；利用油紅O染色檢測細(xì)胞的定向成脂分化能力

4、。結(jié)果顯示SHSH和常用的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)PLL一樣能夠很好地支持BMSCs的生長。BMSCs在SHSH上表現(xiàn)出正常的粘附、鋪展和生長行為。接種后的48 h內(nèi)，與PLL相比較，細(xì)胞呈現(xiàn)較低的增殖速度；之后恢復(fù)為與PLL相同的增殖。經(jīng)過定向成脂誘導(dǎo)，BMSCs在SHSH上能夠分化為脂肪細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)說明SHSH與BMSCs之間具有良好的生物相容性，同時(shí)考慮到其自身優(yōu)秀的力學(xué)性能，SHSH將成為組織工程與再生醫(yī)學(xué)中極具應(yīng)用潛力的生物支架。

5、 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵點(diǎn)的研究 為了研究BMSCs向脂肪細(xì)胞分化過程中間關(guān)鍵點(diǎn)，我們加入脂肪誘導(dǎo)劑對BMSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，分別誘導(dǎo)12 h、18 h、1 d、2d、3d后撤去誘導(dǎo)劑，換入生長培養(yǎng)（L—DMEM+10％FCS），在第6d，第9d時(shí)油紅O染色。結(jié)果顯示BMSCs在加入脂肪誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)12h、18 h后，換入生長培養(yǎng)基，第6d，第9d油紅O染色成陰性：誘導(dǎo)1d、2d、3d后，換入生長培養(yǎng)基，第

6、6d，第9d油紅O染色成陽性。這些數(shù)據(jù)說明BMSCs在向脂肪細(xì)胞分化過程中非?？赡艽嬖谝粋€(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，這個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是細(xì)胞的分化決定點(diǎn)，關(guān)鍵點(diǎn)之前的細(xì)胞仍然未分化，關(guān)鍵點(diǎn)之后的細(xì)胞已經(jīng)被決定了命運(yùn)，即使不存在分化誘導(dǎo)劑，仍然能夠向脂肪細(xì)胞分化。在BMSCs向脂肪細(xì)胞分化過程中它的關(guān)鍵作用時(shí)間點(diǎn)是BMSCs成脂肪誘導(dǎo)24 h。 同時(shí)我們檢測了關(guān)鍵點(diǎn)前后時(shí)間點(diǎn)Rac1及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化：通過western blotting檢測BMSCs向

7、脂肪細(xì)胞分化早期12 h、18 h、24 h、48 h的Rac1及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化；Pull—down assay分析Rac1—GTP及相關(guān)蛋白活性變化。結(jié)果顯示Rac1及其相關(guān)蛋白總蛋白的表達(dá)量發(fā)生了變化；并且Rac1—GTP蛋白隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，在誘導(dǎo)24 h內(nèi)蛋白表達(dá)不斷升高，誘導(dǎo)24 h時(shí)達(dá)到最大，隨后的24 h蛋白表達(dá)下降，低于誘導(dǎo)12 h時(shí)蛋白表達(dá)。RhoA—GTP蛋白表達(dá)則與Rac1—GTP相反，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，R

8、hoA—GIP蛋白表達(dá)逐漸降低，誘導(dǎo)24 h時(shí)降到最低，在隨后的24 h中，RhoA—GTP蛋白表達(dá)則明顯升高，高于誘導(dǎo)12 h時(shí)RhoA的蛋白表達(dá)水平。Cdc42-GTP蛋白表達(dá)在誘導(dǎo)24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，誘導(dǎo)24 h后顯示出與Rac1—GTP蛋白相同的趨勢，表達(dá)下降且低于誘導(dǎo)12 h時(shí)的水平。 總的來說，BMSCs在向脂肪細(xì)胞分化的過程中存在一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，這個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的作用時(shí)間為BMSCs成脂肪誘導(dǎo)24 h時(shí)，在這個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)前后細(xì)胞