多藥物耐藥慢性乙型肝炎患者的HBV準種研究.pdf

1、研究背景:
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝DNA病毒,是引起急、慢性肝炎的主要病原體。全世界約有3.5億感染者,每年大約有100萬患者死于慢性乙型肝炎(CHB)的并發(fā)癥:肝硬化、肝癌、終末期肝病。盡管各種抗病毒藥物的出現(xiàn),給肝炎治療帶來曙光,但由于耐藥株的不斷出現(xiàn),對HBV現(xiàn)癥患者的治療還遠不能達到理想的療效。究其因為,可能與HBV存在的準種現(xiàn)象有關(guān)。因此,HBV準種在病毒逃避宿主免疫

2、監(jiān)視、病毒持續(xù)存在及耐受抗病毒治療中的重要地位正日益受到重視。
　　 病原微生物長期點突變的積累形成不同的基因型和血清型,但是,對于感染單一病原體的具體患者,在較短時間內(nèi)病原微生物核酸的突變則造成體內(nèi)同時存在基因序列有微小差別的種群。種群的各個成員之間差別程度一般不會超過核苷酸總長度的2-5％,這種差別不至于構(gòu)成病原體不同的基因型或血清型,但的確存在基因序列的差別,這種現(xiàn)象就稱為準種(quasispecies)。準種是病原微生物

3、存在的普遍現(xiàn)象和規(guī)律。HBV的生活史是先生成前基因組RNA,以此為模板,通過逆轉(zhuǎn)錄過程復(fù)制子代基因組序列。由于逆轉(zhuǎn)錄酶不具有3ˊ-5ˊ校對功能,子代的HBV基因組與模板比較,存在一定的變異。此特性決定了HBV基因組的高突變性及異質(zhì)性病毒群體存在的可能,即在逆轉(zhuǎn)錄過程中可能產(chǎn)生了準種群?，F(xiàn)在研究準種的實驗方法一般都是應(yīng)用PCR技術(shù)進行基因擴增以后,再進一步作分子生物學技術(shù)分析。研究的主要技術(shù)和方法包括限制性片段長度多態(tài)性(restrict

4、ion fragment length polymorphism,RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformational polymorphism,SSCP)、溫度梯度凝膠電泳(temperatures gradient gel electrophresis,TGGE)、凝膠轉(zhuǎn)移分析、基因克隆與基因測序等。
　　 HBV準種特點的研究對于理解CHB患者臨床耐藥的形成過程和臨床特點具有很大的幫助和意義

5、。從準種特點來看,任何CHB患者血液中的HBV都是以不同種群存在的,種群的性質(zhì)和特點,主要取決于病毒群不同組分的復(fù)制能力和機體的免疫力之間相互作用最終達到的一種平衡的結(jié)果。但是,開始應(yīng)用核苷類似物(Nucleotide analogues,NA)進行抗病毒治療時,這種平衡就被打破了,在藥物選擇的作用下,形成了新的平衡,各種病毒種群所占的相對比率也進行了新的調(diào)整。優(yōu)勢種群和不同的劣勢種群存在著一種轉(zhuǎn)換,稱之為種群的的漂變(shift)。<

6、br>　　 隨著抗病毒藥物的廣泛使用,耐藥性問題日趨嚴重,進行合理有效的抗病毒治療是當務(wù)之急。我們必須將HBV準種與抗病毒藥物敏感性問題聯(lián)系起來,根據(jù)HBV準種檢測結(jié)果來指導(dǎo)抗病毒藥物的選擇和評價抗病毒的療效應(yīng)答。
　　 研究目的:
　　 本研究收集了4例多種(3種或3種以上)抗病毒藥物耐藥的慢性乙型肝炎病例。應(yīng)用多克隆基因測序的方法,通過對其HBV全基因及各ORF的堿基和氨基酸序列的分析,探討多藥物耐藥CHB患者HB

7、V準種和變異特點。并結(jié)合臨床資料,分析HBV準種和變異與多藥物耐藥的關(guān)系,以期發(fā)現(xiàn)新的耐藥位點。
　　 材料和方法:
　　 收集4例經(jīng)過3種以上抗病毒藥物治療,發(fā)生耐藥的CHB患者的血清。
　　 1.采用實時熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA載量:血清HBV DNA載量以拷貝/毫升表示,試劑盒的檢出限度為500拷貝/毫升。實驗重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。
　　 2.HBV全基因組擴增、克隆及篩選:采用長片

8、段PCR方法一次擴增HBV全基因組并克隆入pMD20-T載體,PCR篩選陽性克隆。病例1、2、3和4分別選取22、22、20和20個陽性克隆。
　　 3.HBV全基因組測序:陽性克隆提取質(zhì)粒DNA,設(shè)計測序引物,分5段測序,然后用序列拼接軟件Sequencer,將各段DNA序列拼接得到HBV全基因組。
　　 4.HBV DNA的生物信息學分析:將獲得的HBV DNA序列用DNAStar進行比對和分析,探討多藥物耐藥的CH

9、B患者HBV準種和變異特點。
　　 結(jié)果:
　　 1.4例患者全部成功擴增出HBV全長并多克隆測序得到HBV DNA全序列。
　　 2.全部HBV基因型均為B型,血清型均為adw型。
　　 3.4例患者的全基因堿基序列同源性分別為98.5-99.8％、98.3-99.7％、98.2—99.7％和98.8—99.7％；preC/C區(qū)的堿基序列同源性分別為97.5-100％、97.1—100％、97.3-99

10、.8％和98.4-100％；全S區(qū)的堿基序列同源性分別為98.4—99.8％、98.7-99.9％、97.7—100％和98.3-99.8％；P區(qū)的堿基序列同源性分別為99.2—99.8％、99.1-99.8％、98.7-100％和99.1-100％；X區(qū)的堿基序列同源性分別為98.0-100％、97.3-100％、98.7-100％和99.1-100％。
　　 4.HBV核酸序列和氨基酸序列的遺傳進化樹分析顯示來自同一患者的H

11、BV序列被歸納到同一分支中。
　　 5.病例1、2和3的HBV DNA序列均發(fā)現(xiàn)大片段缺失現(xiàn)象,尤其病例2的大片段缺失現(xiàn)象發(fā)生頻率高。
　　 6.病例1和病例4的nt1896G-A終止突變頻率高,分別為19/22和20/20；病例1的全部克隆(22個)均檢測到nt1762+nt1764雙突變,病例2的nt1896G—A終止突變和nt1762+nt1764雙突變出現(xiàn)頻率各為1/20。
　　 7.病例1、3、4均檢測

12、出rtL180M和rtM204V/I耐藥突變,rtL180M變異發(fā)生頻率分別為19/22、18/20、19/20；rtM204V/I變異發(fā)生頻率分別為19/22、20/20和20/20。
　　 8.RT區(qū)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)未報道的高頻率突變,如rt91、rt222、rt271等。S區(qū)的195位氨基酸出現(xiàn)高頻率的I→M變異,C區(qū)的135位氨基酸出現(xiàn)高頻率的P→Q變異。
　　 結(jié)論:
　　 1.慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的

13、HBV以準種形式存在并貫穿于HBV整個基因組。
　　 2.不同患者的HBV準種呈現(xiàn)一定的個體特異性。HBV核酸序列和氨基酸序列的遺傳進化樹分析顯示來自同一患者的HBV序列全部被歸納到同一分支中,不同患者來源的HBV序列在遺傳進化樹中歸屬于不同分支,沒有相互交叉現(xiàn)象,而且不同患者的各ORF的遺傳距離有所不同；來源于不同患者的HBV在某位點上編碼的氨基酸是不同的,但來源于同一患者的不同克隆在同一位點的編碼氨基酸是相同的。這種個體特異