IL-2和IL-15對臍血天然免疫細胞分化的不同效應及其機制.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是機體抵御外來微生物抗原入侵的第一道防線。自然殺傷細胞(NK細胞)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機體抗御感染和防止細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要的免疫調(diào)節(jié)細胞。NK細胞不表達典型的抗原識別受體，不需預先活化就能夠識別并殺傷異常細胞，并迅速分泌可溶性因子包括趨化因子和細胞因子，在機體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和造血調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。NKT細胞也是機體天然免疫系統(tǒng)的重要的細胞群體，它既表達特異性的T細胞的標志，又表達NK細胞的標志，通

2、過分泌細胞因子和殺傷功能在對感染、腫瘤、移植、自身免疫性疾病、炎癥等的免疫應答中發(fā)揮重要作用。 IL-2與IL-15是γc家族細胞因子的成員，它們是重要的細胞生長因子，能夠調(diào)控淋巴細胞的增殖、活化和生存。雖然IL-2和IL-15受體含有相同的β和γ亞單位，能夠活化下游共同的JAK-STAT等信號通路，但是在許多適應性免疫應答中，IL-2和IL-15表現(xiàn)出了不同的甚至相反的功能。臍血中含有大量未成熟的細胞和造血前體細胞，具有分化潛

3、能，研究這些細胞在IL-2和IL-15作用下的發(fā)育分化情況，將有利于發(fā)現(xiàn)些許天然免疫細胞發(fā)育分化的線索，以及IL-2和IL-15在其中的不同作用，為以臍血天然免疫細胞為基礎(chǔ)的生物治療提供理論依據(jù)。 NK92細胞是一種自然殺傷細胞系，具有與人活化的NK細胞相似的表型特征和功能特點，是研究NK細胞功能的很好的工具。NK92細胞無需抗原預先作用，就可直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細胞，可在體外長期培養(yǎng)大量擴增，具有廣譜抗腫瘤作用，使其成為

4、一種有效的免疫治療劑。我們對NK92細胞殺傷靶細胞的可能的殺傷機制進行了探索，以期為有效的NK細胞治療的提供線索。 本實驗中，我們分離臍血單個核細胞，分別加入IL-2和IL-15進行培養(yǎng)，采用流式細胞術(shù)檢測細胞的表型以及各細胞群體的比例，結(jié)合細胞計數(shù)推算各細胞群體的細胞數(shù)量；利用EI+ISA方法和胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù)，檢測特定細胞細胞因子的分泌情況；利用Annexin V染色和胞內(nèi)Bcl-2和Bcl-xL染色，分析細胞亞群的凋亡

5、情況；利用MACS和FACS純化細胞，檢測特定純化細胞在不同刺激因素作用下的變化情況；利用<'51>Cr釋放法檢測細胞對K562細胞的殺傷活性；利用流式細胞術(shù)檢測細胞與細胞的結(jié)合和細胞內(nèi)信號通路的活化；利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和熒光抗體，觀察細胞-細胞之間的免疫突觸，相關(guān)分子在細胞表面分布的情況以及信號分子的活化。通過上述研究方法，我們初步獲得了以下結(jié)果以及結(jié)論： 1.臍血NK細胞活性低與其高表達NKG2A/CD94和低表達顆粒

6、酶B有關(guān)首先我們對臍血NK細胞的比例和殺傷功能的檢測發(fā)現(xiàn)，盡管臍血NK細胞和CD8<'+>NK細胞的比例都高于外周血，但是臍血NK細胞的殺傷功能卻顯著低于外周血NK細胞。分析NK細胞受體的表達發(fā)現(xiàn)，活化性NK細胞受體CD16，NKG2D和NKp46的表達在臍血和外周血NK細胞沒有差異，但是抑制性NKG2A/CD94受體的表達在臍血NK細胞明顯增高。對于殺傷效應分子的檢測發(fā)現(xiàn)，顆粒酶B在臍血NK細胞的表達明顯低于外周血NK細胞，而細胞內(nèi)穿

7、孔素，IFN-γ，TNF-α的表達，以及膜表面FasL和TRAIL，的表達在臍血和外周血NK細胞沒有明顯差異。 綜上所述，抑制性NKG2A/CD94受體的高表達和顆粒酶B的低表達與臍血NK細胞活性低有關(guān)系。 2.IL-15抗臍血CD56<'dim>細胞凋亡的作用與Bcl-xL有關(guān)比較分析IL-2和IL-15對臍血NK細胞的作用發(fā)現(xiàn)，IL-15能夠促進CD56<'bright>NK細胞和CD56<'dim>NK細胞的增殖，

8、而IL-2只能維持CD56<'bright>NK細胞的生存。IL-15培養(yǎng)的NK細胞凋亡的比例明顯低于IL-2，凋亡細胞大都為CD56<'dim>NK細胞，而且抗IL-2的中和抗體能夠協(xié)同IL-15減少NK細胞的凋亡。應用純化的CD56<'dim>NK細胞做進一步研究得到同樣的結(jié)果。對抗凋亡蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，Bcl-2的表達在IL-2和IL-15培養(yǎng)的CD56<'bright>NK細胞和CD56<'dim>NK細胞中沒有明顯差異；與IL-

9、2相比，IL-15培養(yǎng)的NK細胞表達高水平的Bcl-xL，而且CD56<'bright>NK細胞Bcl-xL的表達高于CD56<'dim>NK細胞。這提示，Bcl-xL在IL-15抗NK細胞凋亡中起重要作用。此外，對IL-2Rα和IL-15Rα的檢測發(fā)現(xiàn)，IL-15能夠顯著上調(diào)NK細胞IL-2Rα的表達并能更好的維持IL-15Rα的表達。 綜上所述，IL-2促進CD56<'dim>NK細胞凋亡而IL-15能夠抑制其凋亡，IL-1

10、5的抗凋亡作用與Bcl-xL的高表達相關(guān)。因此IL-15在維持CD56<'dim>NK細胞的長期的功能中起重要作用。 3.IL-2和IL-15對臍血NKT樣細胞的發(fā)育和活化產(chǎn)生不同的作用利用體外長期臍血單個核細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，CD3<'+>CD56<'+> NKT樣細胞由CD34<'->CD56<'->細胞發(fā)育而來，CD34<'+>細胞和CD56<'+>細胞在IL-2或者IL-15的作用下只能產(chǎn)生極少量的NKT樣細胞。IL-2促進N

11、KT樣細胞增殖的能力高于IL-15；但是IL-15培養(yǎng)的NKT樣細胞的活化程度(表達高水平的活化標志CD161，CD25和IFN-γ)高于IL-2組而凋亡比例低于IL-2組。對Bcl-xL的檢測發(fā)現(xiàn)， IL-15培養(yǎng)的NKT樣細胞Bcl-xL的表達高于IL-2組。 綜上所述，IL-2能夠促進NKT樣細胞增殖，但是IL-15可以更有效的活化NKT樣細胞，并使其維持更高的活性。IL-15的這些作用可能與其在GVHD中的致病作用有關(guān)系

12、。 4.ERK1/2通路在以CD11a和CD2為基礎(chǔ)的NK92細胞的殺傷中起重要作用首先利用流式細胞術(shù)能夠檢測到NK92細胞與靶細胞的結(jié)合，而且NK92細胞的殺傷活性與效靶細胞結(jié)合的比例有關(guān)，結(jié)合率越高，殺傷功能越強。許多因素都能影響NK92與靶細胞的結(jié)合，如抑制性NK受體的表達，細胞膜流動性的破壞，EDTA等。對細胞粘附分子的研究發(fā)現(xiàn)，CD11a和CD2在NK92細胞和K562細胞相互作用的界面上有聚集現(xiàn)象，提示二者可能在NK