體外構(gòu)建雙高動(dòng)子SECs及其對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶活性的干擾作用.pdf

1、中圖分類號(hào)＆2三：3UDC610碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼!Q5三3密級(jí)公玨體外構(gòu)建雙啟動(dòng)子SECs及其對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶活性的干擾作用ConstructionofdualpromotersSECsinvitroanditsinerfering：ffectlomeraseactivi白inHepG2cellsnterteringeftectontelomeraseactivityinHep(52cells1作者學(xué)科研究學(xué)院(指導(dǎo)名：業(yè)：向

2、：、所)：師：龔霞臨床醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系彭劍雄副教授論文答辯日期_噬5、一答辯委員會(huì)主席中南大學(xué)2014年5月姓專方系教體外構(gòu)建雙啟動(dòng)子SECs及其對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶活性的干擾作用摘要目的：構(gòu)建針對(duì)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)基因的H1／U6雙啟動(dòng)子表達(dá)框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)并研究其轉(zhuǎn)錄生成的siRNA／mi

3、RNA對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)端粒酶活性的干擾作用，以確定siRNA／miRNA表達(dá)載體的有效性，探索制備干擾性RNA的新途徑，從而為人類腫瘤的治療提供新方法。方法：利用融合PCR技術(shù)，針對(duì)人端粒酶hTERT基因開放閱讀區(qū)1800—1818和26502668位點(diǎn)構(gòu)建2條H1／U6雙啟動(dòng)子SECs，針對(duì)其37端非翻譯區(qū)3878—3896和39643982位點(diǎn)構(gòu)建2條H1／U6雙啟動(dòng)子SECs，并構(gòu)建一隨機(jī)序列干擾片段為對(duì)照。利用陽離子聚

4、合物轉(zhuǎn)染試劑以及磷酸鈣共沉淀法兩種方法分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄生成siRNA或miRNA。利用TRAP。PCR一銀染法檢測(cè)端粒酶活性，并對(duì)其電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算端粒酶活性抑制率；用SYBRGreenI熒光定量法直接定量端粒酶活性，分析H1／U6雙啟動(dòng)子SECs對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶活性的干擾作用。結(jié)果：25％的瓊脂糖凝膠電泳分析以及測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了針對(duì)端粒酶hTERT的H1／U6雙啟動(dòng)子SECs。與對(duì)照組相比，針對(duì)不同位

5、點(diǎn)的SECs的各轉(zhuǎn)染組，端粒酶活性出現(xiàn)不同程度的抑制。采用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染法，針對(duì)位點(diǎn)1800—1818、2650—2668、38783896和3964—3982的各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞端粒酶活性抑制率分別為4238％、6180％、7795％、7951％；采用磷酸鈣共沉淀法各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞端粒酶活性抑制率分別為2019％、2738％、4253％、643％。結(jié)論：利用融合PCR成功構(gòu)建了SECs，并且其對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶hTERT基因表達(dá)有明顯的干