全轉(zhuǎn)錄工程方法(gTME)改良釀酒酵母的初步研究.pdf

1、在不可再生能源資源的日益枯竭，石油價格屢創(chuàng)新高以及石油燃燒所帶來的環(huán)境污染，溫室效應等一系列問題的情況下，生物煉制受到世界各國的普遍關注，生物燃料作為一種新興產(chǎn)業(yè)在全球崛起。燃料乙醇被認為最有發(fā)展前景的可再生綠色能源之一。釀酒酵母是乙醇生產(chǎn)的主要菌株。
　　 本文從自然界分離得到160株酵母，經(jīng)過TTC一級篩選、糖濃度耐性二級篩選和葡萄糖發(fā)酵三級篩選獲得7株發(fā)酵性能較好的菌株。對GX1、GX7、GX140菌株進行分子鑒定，結果表

2、明三株都是酵母屬（Saccharomyces）釀酒酵母（Saccharomyces scerevisiae）。對GX7菌株G418抗性實驗表明，在100μ/ml時菌株不能生長，初步發(fā)酵性能的研究，產(chǎn)乙醇11.04％。
　　 本研究克隆了釀酒酵母PGK啟動子，利用報告基因-綠色熒光蛋白（GFP）進行了活性功能驗證，結果表明PGK啟動子具有活性功能。構建了含G418抗性篩選標記和組成型PGK啟動子的載體pYX418。利用全轉(zhuǎn)錄工程（

3、gTME）方法對野生型釀酒酵母（Saccharomyces scerevisiae）GX7菌株進行了改造。
　　 本研究通過PCR方法克隆獲得釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子spt15基因，與表達載體pYX418連接，構建了重組子pYX418-spt15，并對SPT15蛋白的177、195和217位點進行了定點突變（Phe177Ser、Tyr195His和Lys218Arg），然后醋酸鋰轉(zhuǎn)化入釀酒酵母GX7中，利用不同濃度的G418抗性篩選得到