小鼠體內(nèi)Perlecan∕VEGF-165促進(jìn)血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、血管生成在組織損傷修復(fù)的過程中起著非常重要的作用。新生血管為細(xì)胞增殖和組織修復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)和氧離子。血管的生長(zhǎng)分化是一個(gè)動(dòng)態(tài)化的復(fù)雜過程，時(shí)間和空間上受多種信號(hào)分子、細(xì)胞外基質(zhì)、間充質(zhì)細(xì)胞的嚴(yán)格調(diào)控。近來的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞參與血管生成，并且內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成過程起著十分重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞上各因子的表達(dá)升高或降低可以促進(jìn)或抑制血管生成。內(nèi)皮細(xì)胞成分復(fù)雜，其中Perlecan和VEGF-165是與血管生成關(guān)系密切的主要成分。
　　Per

2、lecan是基底膜上和細(xì)胞間質(zhì)中最主要的基底膜蛋白多糖，是一種大分子多結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外基底膜蛋白多糖，是脊椎動(dòng)物最大的單鏈多肽分子之一。Perlecan的蛋白核心結(jié)構(gòu)分為五個(gè)區(qū)域，這五個(gè)區(qū)域分別與相應(yīng)物質(zhì)的形成有關(guān)，還可以在組織生長(zhǎng)、重塑、腫瘤生長(zhǎng)過程中改變多肽鏈的形態(tài)從而最大化的發(fā)揮各自的作用。Perlecan存在于大部分的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜上，參與調(diào)節(jié)血管生成，具有儲(chǔ)存、保護(hù)、加強(qiáng)血管生長(zhǎng)因子的功能，在調(diào)節(jié)血管生物學(xué)行為和組

3、織損傷修復(fù)過程中具有很重要的作用。Perlecan參與血管生成過程，新形成的血管周圍可以檢測(cè)到Perlecan的高水平表達(dá)。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-165）是最先發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，被認(rèn)為是血管生長(zhǎng)因子家族最典型的代表，它的主要特征是對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起調(diào)控作用，廣泛存在于血管內(nèi)皮。VEGF-165的發(fā)現(xiàn)改變了血管生成領(lǐng)域的研究，能直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)，同時(shí)VEGF-165還可以和基底膜蛋白多糖的硫酸乙酰肝素鏈結(jié)合促進(jìn)血

4、管生成。
　　聚乳酸(polylactic acid，PLA)是目前最常采用的構(gòu)建組織工程血管的支架材料。OPLA支架是由D，D-L，L聚乳酸形成的復(fù)合支架，復(fù)合支架本身的三維多孔結(jié)構(gòu)和連通性有利于細(xì)胞的粘附、遷移、增殖，具有優(yōu)良的可降解性，可塑性，良好的生物相容性，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和支架的血管化，因此我們采用這種支架和Perlecan、VEGF-165相結(jié)合的方法，發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，在體研究促進(jìn)血管生成效果。
　　本課題

5、將提純的Perlecan和VEGF-165植入小鼠體內(nèi)，促進(jìn)局部血管生成，具有仿生性，可以模擬自身血管生成過程。本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀察重組生物材料在具有正常排異反應(yīng)的小鼠體內(nèi)的生物相容性，并分別定性、定量分析復(fù)合支架的促血管生成情況，這樣不僅可以改進(jìn)現(xiàn)有生物材料和組織工程支架的性能，還很有可能成為一種治療血管損傷、促進(jìn)血管改型的有效手段，為臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供準(zhǔn)確的理論參數(shù)?；诖?，本研究將致力于研究復(fù)合支架的促血管生成性能，使該重組復(fù)合材

6、料具有更深遠(yuǎn)更廣泛的實(shí)用價(jià)值。
　　吳丹已經(jīng)證實(shí)Perlecan的制備和純化過程的可靠性以及Perlecan與VEGF-165結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性，本實(shí)驗(yàn)鑒于之前的研究成果進(jìn)一步進(jìn)行，研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.小鼠體內(nèi)重組材料促血管生成的定性分析
　　采用由D，D-L，L聚乳酸形成的復(fù)合支架OPLA，OPLA具有多孔小平面結(jié)構(gòu)，有利于各種因子的吸附。支架分為無處理組和處理組，處理組為：表面吸附 VEGF-165的聚乳酸復(fù)

7、合支架、表面吸附有Perlecan的聚乳酸復(fù)合支架、表面吸附有Perlecan+ VEGF-165的聚乳酸復(fù)合支架；無處理組為OPLA支架。復(fù)合支架植入小鼠體內(nèi)，在特定時(shí)間點(diǎn)取出植入材料，HE染色，觀察促血管生成情況，定性分析重組支架的促血管生成效果。我們發(fā)現(xiàn)：隨時(shí)間延長(zhǎng)OPLA支架逐漸降解，與周圍組織有良好的生物相容性，復(fù)合支架內(nèi)部血管長(zhǎng)入逐漸增多，管徑增大，管壁增厚，血管逐漸成熟，血管伴隨組織逐漸深入支架內(nèi)部；支架吸收嚴(yán)重。各組都可

8、觀察到血管生成，從HE染色切片上可觀察到處理組的血管生成較多，尤其是OPLA+Perlecan+VEGF-165組最多。
　　2.小鼠體內(nèi)重組材料促血管生成的定量分析
　　通過血管生成的定量分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中微血管密度（MVD）增長(zhǎng)最緩慢。OPLA+VEGF-165組在1周時(shí)與對(duì)照組差異不明顯，2周時(shí)增速迅速增大，MVD幾乎是對(duì)照組的兩倍，與OPLA+Perlecan組沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但第3周時(shí)，OPLA+

9、VEGF-165組MVD與對(duì)照組已無顯著性差異，與 OPLA+Perlecan組、OPLA+VEGF-165+Perlecan組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血管生成速度明顯減慢；4周、6周、8周時(shí)OPLA+VEGF-165組MVD與OPLA+Perlecan組、OPLA+Perlecan+VEGF-165組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明VEGF-165在2周時(shí)釋放較快,促血管生成作用在2周時(shí)達(dá)到高峰。OPLA+Perlecan組與OPLA+Perle

10、can+VEGF-165組在1周時(shí)MVD差異不明顯，2周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3周時(shí)差異變小，但明顯高于對(duì)照組，說明雖然 Perlecan可以很好的促進(jìn)血管生成，結(jié)合了VEGF-165的Perlecan促血管發(fā)生作用更強(qiáng)，同時(shí)從另一個(gè)側(cè)面說明了VEGF-165在2周時(shí)釋放較快。OPLA+Perlecan+VEGF-165組的MVD均高于OPLA+Perlecan組，1周時(shí)，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2周時(shí)前者M(jìn)VD明顯高于后者，推測(cè)是因?yàn)榇藭r(shí)