血管生成抑制因子arresten基因?qū)?shí)驗(yàn)性肝癌的體內(nèi)外研究.pdf

1、研究背景：轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，是導(dǎo)致腫瘤患者臨床治療失敗和死亡的主要因素。而血管生成是腫瘤惡性生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)并具有致死性的先決條件。腫瘤血管生成取決于腫瘤組織中血管生成正負(fù)調(diào)控因子之間的局部平衡關(guān)系。給予血管生成抑制劑，抑制腫瘤新生血管形成，可抑制原發(fā)腫瘤以及轉(zhuǎn)移瘤灶的生長(zhǎng)，抑制或治愈由于微小病灶引起的臨床復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定腫瘤病情、防止術(shù)后復(fù)發(fā)、提高術(shù)后無(wú)瘤生存率等目的。抑制腫瘤血管生成是抗

2、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療的重要策略。Arresten是最近發(fā)現(xiàn)的一種基底膜來(lái)源的血管生成抑制因子，是Ⅳ型膠原α1鏈的羧基末端NCl結(jié)構(gòu)域多肽片段。Arresten可有效抑制血管生成及腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，在腫瘤抗血管生成治療方面有著良好的應(yīng)用前景。前期我們采用RT-PCR方法和基因重組技術(shù)，已成功地完成了人Arresten基因的分子克隆與序列測(cè)定并已構(gòu)建Arresten基因的原核表達(dá)載體，且在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。本課題延續(xù)前期的工作，繼續(xù)完成真核

3、表達(dá)載體的構(gòu)建，并對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌的體內(nèi)外兩個(gè)方面進(jìn)行研究。 目的：構(gòu)建arresten基因的真核表達(dá)載體，并建立肝癌的裸鼠移植瘤模型，觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及血管生成的影響；同時(shí)在體外研究arresten基因?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。 方法：根據(jù)重組質(zhì)粒pGEMArr(前期構(gòu)建)中的人arrestencDNA序列及其真核表達(dá)載體pSecTag2-B的多克隆位點(diǎn)編碼序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物P1和P2。以重組質(zhì)粒pGEMArr為

4、模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKits進(jìn)行回收和純化，取純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約30ng和pSecTag2-B質(zhì)粒載體大片段約75ng，在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。取10μl純化的各質(zhì)粒樣品，用內(nèi)切酶BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切鑒定正確的陽(yáng)性克隆，命名為pSTbAT。取純化的各重組質(zhì)粒樣品，采用ABI公司377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。用DNAssist及DN

5、AMAN分析軟件對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行序列分析，并與前期克隆的人arrestencDNA序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，以確認(rèn)目的基因序列及重組表達(dá)質(zhì)粒的密碼子閱讀框是否正確。確定成功后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的HepG-2肝癌細(xì)胞系1×107個(gè)細(xì)胞懸浮于0.2ml的生理鹽水中，在無(wú)菌條件下接種于裸鼠前肢皮下，每3～4天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小并記錄和繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，待腫瘤長(zhǎng)至0.2cm3時(shí)進(jìn)行如下治療：治療組(8只)以將pSTbAT30ug與Lipof

6、ection200030ul混懸后直接瘤內(nèi)注射，每3天一次，共3周，對(duì)照組(8只)以生理鹽水60ul按同治療組時(shí)間段瘤內(nèi)注射。治療4周后處死動(dòng)物，測(cè)量?jī)山M腫瘤平均體積，采集腫瘤標(biāo)本，采用SABC法進(jìn)行CD34免疫組化染色，并計(jì)算兩組微血管密度。分別培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞和ECV-304細(xì)胞，按Lipofection2000說(shuō)明書(shū)將pSTbAT按不同比例(DNA/脂質(zhì)體)轉(zhuǎn)染至HepG-2細(xì)胞，并收集其上清液。離心后的細(xì)胞用RT-PCR鑒定

7、。將上清液加入含ECV-304細(xì)胞的培養(yǎng)皿內(nèi)，觀察上清液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制效應(yīng)。 結(jié)果：取經(jīng)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAssist和DNAMAN分析軟件分析比較，三個(gè)克隆的核苷酸序列完全相同；序列比對(duì)分析表明，測(cè)序結(jié)果與前期克隆的人arrestencDNA序列完全一致，即插入到表達(dá)載體中的目的基因正確。分析重組表達(dá)質(zhì)粒的密碼子開(kāi)放閱讀框，結(jié)果表明插入的arresten基因片段與表達(dá)載體的密碼子閱讀

8、框相吻合；即arresten基因完整、準(zhǔn)確地克隆入表達(dá)載體中，保證了目的蛋白能正確表達(dá)。成功構(gòu)建arresten基因的真核表達(dá)載體pSTbAT。裸鼠成瘤后，將脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物按不同比例直接注射到瘤體后，腫瘤體積較對(duì)照組小；免疫組化結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織的微血管密度15.3個(gè)陽(yáng)性血管/10個(gè)視野，對(duì)照組平均¨2.5個(gè)陽(yáng)性血管/10個(gè)視野，兩者相比有顯著性差異。轉(zhuǎn)染后各上清液均對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有抑制作用，將遷移距離0.25mm劃分為3個(gè)