多囊卵巢綜合征表型分析及易感基因基因型-表型關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、第一部分：多囊卵巢綜合征患者臨床亞型特點(diǎn)分析
　　 背景:
　　 多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，主要影響育齡期女性，發(fā)病率可高達(dá)6-8％。它不只是單一的病理生理?yè)p害，而是一組癥狀的集合，因而具有高度的臨床異質(zhì)性。主要癥狀包括月經(jīng)異常、多毛、肥胖、高黃體生成素(LH)血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、高脂血癥等，其中具有診斷意義的為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)(OA)、高雄激素血癥和/或多毛(HA)以及卵巢形態(tài)學(xué)

2、改變（多囊卵巢或卵巢體積增大）(PCO)。2003年歐洲生殖協(xié)會(huì)和美國(guó)人類生殖協(xié)會(huì)提出的Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PCOS的診斷進(jìn)行了明確規(guī)定，以上三條中只要滿足兩條并排除其它疾病即可診斷?；谠摌?biāo)準(zhǔn)，PCOS可分為四種亞型:亞型A患者表現(xiàn)為高雄激素和稀發(fā)/無(wú)排卵，卵巢形態(tài)正常(經(jīng)典型1，OA+HA);亞型B則同時(shí)具有三種特征性表型(經(jīng)典型2，OA+HA+PCO);亞型C患者排卵功能正常，有規(guī)律的月經(jīng)周期，但存在高雄激素和卵巢多囊樣改變的

3、證據(jù)(高雄PCO型，HA+PCO);亞型D患者表現(xiàn)為稀發(fā)/無(wú)排卵和卵巢大量小卵泡推積，其血清雄激素在正常范圍內(nèi)，亦無(wú)臨床高雄激素表現(xiàn)(無(wú)排卵PCO型，OA+PCO)。大量研究證實(shí)不同亞型患者在代謝損害和生殖障礙方面都有不同程度的表現(xiàn)。無(wú)PCO表現(xiàn)者（亞型A）代謝損害可能更嚴(yán)重，而雄激素正常的患者（亞型D）則相對(duì)較輕，也有學(xué)者認(rèn)為同時(shí)具有無(wú)排卵和高雄激素表型的患者（亞型A和亞型B）肥胖、胰島素抵抗和心血管疾病及糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均高于其它亞型

4、。這種高度的臨床異質(zhì)性給PCOS基礎(chǔ)和臨床相關(guān)研究均造成很大困難。因此，準(zhǔn)確識(shí)別各亞型的臨床特點(diǎn)，正確評(píng)估其內(nèi)分泌及代謝改變對(duì)合理診斷和治療PCOS，探索疾病的發(fā)病機(jī)制意義重大。
　　 目的:
　　 本研究旨在通過(guò)大樣本臨床數(shù)據(jù)分析，明確不同亞型PCOS患者臨床特點(diǎn)及意義，為進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 選取Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)診斷的PCOS患者5287例，正常對(duì)照女性2

5、016例。按患者臨床特點(diǎn)分為四個(gè)亞型組:亞型A(OA+HA)、亞型B(OA+HA+PCO)、亞型C(HA+PCO)、亞型D(OA+PCO)。比較各組患者以及正常對(duì)照間人體測(cè)量學(xué)參數(shù)、內(nèi)分泌指標(biāo)和代謝特點(diǎn)的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.基本特點(diǎn):四種亞型BMI相近，均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。無(wú)排卵PCO型患者(亞型D)m-FG評(píng)分低于有高雄激素表現(xiàn)的亞型（亞型A、B、C）(P＜0.01)，后者各組間無(wú)差異。

6、>　　 2.內(nèi)分泌特點(diǎn):各亞型患者LH、LH/FSH均高于對(duì)照組(P＜0.01)。在患者人群內(nèi)，同時(shí)具有無(wú)排卵、高雄激素和PCO三種表現(xiàn)的患者（亞型B）LH水平和LH/FSH比值較其它三個(gè)亞型組更高（P值均＜0.01）。血清T水平在各組受試者間也存在差異，有高雄激素表現(xiàn)的亞型組（亞型A、B、C）血清T最高，無(wú)排卵PCO型患者（亞型D）其次，對(duì)照組最低。三者呈階梯狀遞減，均數(shù)差異顯著（組間比較P值均＜0.01）。
　　 3.血糖

7、代謝特點(diǎn):亞型B（經(jīng)典型2）和亞型D（無(wú)排卵PCO型）組患者INSO水平高于對(duì)照組(P＜0.01)。關(guān)于HOMA-IR，亞型D（無(wú)排卵PCO型）最高，亞型B（經(jīng)典型2）其次，亞型A（經(jīng)典型1）、亞型C（高雄PCO型）和對(duì)照組最低（P值均＜0.01），且后三組間無(wú)顯著差異。上述結(jié)果在較正BMI后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　 4.血脂代謝特點(diǎn):各組受試者間CHOL差異不大。四個(gè)患者組TG水平均高于對(duì)照，而HDL-C水平

8、低于對(duì)照（P值均＜0.01）。在患者人群中，亞型D（無(wú)排卵PCO型）血清LDL-C最高，亞型B（經(jīng)典型2）其次，亞型C（高雄PCO型）最低（P值均＜0.01）。較正BMI后除TG(P=0.721)外，其它結(jié)果仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 與對(duì)照人群相比，四種亞型的PCOS患者均存在一定程度的內(nèi)分泌紊亂和雄激素過(guò)量狀態(tài)，其中同時(shí)具有OA、HA和PCO三個(gè)特點(diǎn)的亞型組（亞型B）患者表現(xiàn)更重，而無(wú)排

9、卵PCO型患者（亞型D）則相對(duì)較輕。但后者在所有患者中所占比重最大，在糖脂代謝方面的異常改變也更明顯。可見(jiàn)，各亞型PCOS可能具有不同的病理生理機(jī)制。
　　 第二部分：基于PCOS患者的PCOS易感基因基因型-表型關(guān)聯(lián)性分析
　　 背景:
　　 多囊卵巢綜合征(PCOS)患者臨床表型具有高度異質(zhì)性，高雄激素血癥、高LH血癥等內(nèi)分泌異常以及高血糖、胰島素抵抗、高脂血癥等代謝異常在PCOS女性中發(fā)生率均較高。該綜合征

10、病因復(fù)雜，目前較為公認(rèn)的觀點(diǎn)為遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。既往大量分子遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)多個(gè)PCOS相關(guān)基因，但作為復(fù)雜遺傳性疾病，多基因致病以及遺傳與環(huán)境之間的相互作用致使單基因關(guān)聯(lián)性研究在探索PCOS候選基因方面作用甚微。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)基于基因芯片技術(shù)，通過(guò)對(duì)個(gè)體全部或大部分基因的高效檢測(cè)和比對(duì)，為我們打開了一扇研究復(fù)雜性疾病的大門。它將患者與對(duì)照組全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)出的SNP位點(diǎn)進(jìn)行比較，確定所有的變異等位基因頻

11、率。與候選基因策略需要預(yù)先假設(shè)致病基因相比，GWAS研究能更系統(tǒng)、更全面的反應(yīng)疾病的遺傳易感性。關(guān)于PCOS的前期GWAS研究對(duì)上萬(wàn)例患者和等比例對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)和分析，共發(fā)現(xiàn)15個(gè)PCOS易感SNP(PCOS-SNP)，分別位于11個(gè)基因座。其中一期GWAS提示了2p16.3、2p21和9q33.3三個(gè)易感區(qū)域與PCOS發(fā)病相關(guān)，LHCGR、THADA和DENND1A基因內(nèi)的5個(gè)SNP(rs13405728、rs13429458、rs12

12、478601、rs2479106、rs10818854)被證實(shí)為PCOS-SNP。之后二期GWAS在重復(fù)了上述結(jié)果外又新發(fā)現(xiàn)了8個(gè)基因座，經(jīng)兩次獨(dú)立樣本的驗(yàn)證證實(shí)C9orf3基因rs4385527和rs3802457位點(diǎn)、YAP1基因rs1894116位點(diǎn)、RAB5B基因rs705702位點(diǎn)、HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)、TOX3基因rs4784165位點(diǎn)、INSR基因rs2059807位點(diǎn)、SUMO1P1基因rs6022786

13、位點(diǎn)以及FSHR基因rs2268361和rs2349415位點(diǎn)等位基因頻率在病例和對(duì)照之間存在顯著差異。在這些候選基因中，LHCGR、FSHR及INSR由于處于卵泡發(fā)育或胰島素代謝的重要通路，早在其它單基因篩查中得以證實(shí)。但其它基因在之前的PCOS相關(guān)報(bào)道中并未提及。通過(guò)復(fù)習(xí)既往基礎(chǔ)研究，推測(cè)THADA和HMGA2作為糖尿病易感基因可能在胰島素代謝方面發(fā)揮作用;YAP、HMGA2基因由于與細(xì)胞增殖相關(guān)，可能參與卵巢形態(tài)學(xué)改變的機(jī)制;LH

14、CGR、RAB5基因與部分細(xì)胞活動(dòng)如胞吞作用、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān)，可能影響了一些效應(yīng)細(xì)胞的功能。但對(duì)于上述基因與PCOS表型的關(guān)系，以及其對(duì)于不同表型的遺傳貢獻(xiàn)仍屬未知。明確這些疾病易感基因與表型的關(guān)聯(lián)性有助于進(jìn)一步深入探討基因的功能和在PCOS發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 目的:
　　 對(duì)納入GWAS研究的PCOS患者表型信息進(jìn)行分析，探討PCOS易感基因的基因型與表型的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步探索上述基因在PCOS發(fā)病機(jī)制中的

15、作用提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 統(tǒng)計(jì)分析前期GWAS研究所納入的患者的臨床資料，分別根據(jù)各SNP的基因型頻率選擇合適的遺傳模型對(duì)PCOS患者進(jìn)行分組，比較不同基因型患者間內(nèi)分泌及代謝表型的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.rs13429458(THADA)位點(diǎn)從基因型患者血清T、LH及LH/FSH比值高于AC+CC基因型(P值分別為0.02、0.03、0.02)。在較正年齡和BMI后，結(jié)果均仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

16、義（Padjust分別為＜0.01、0.02、＜0.01）。
　　 2.rs12478601(THADA)位點(diǎn)CC基因型患者血清LDL較CT+TT組更高(P=0.02)。結(jié)果在較正年齡和BMI后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Padjust=0.02）。
　　 3.rs2479106(DENND1A)位點(diǎn)GG+AG基因型患者OGTT后2小時(shí)血清胰島素水平顯著高于從組(P=0.02)。結(jié)果在較正年齡和BMI后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Padjust

17、=0.02）。
　　 4.rs2349415(FSHR)位點(diǎn)CC基因型患者血清T水平較CT+TT基因型者明顯增加(P＜0.01)。結(jié)果在較正年齡和BMI后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Padjust＜0.01）。
　　 5.rs4385527(C9orf3)位點(diǎn)AG+AA基因型組BMI較GG組高(P=0.01)，其LDL-C水平也較高，而HDL-C水平則較低（P值均＜0.01）。較正年齡和BMI后結(jié)果仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Padjust＜0

18、.01）
　　 6.rs2272046（HMGA2）位點(diǎn)CC+CA基因型組LDL-C水平顯著高于從組(P＜0.01)，較正年齡和BMI對(duì)結(jié)果無(wú)影響（Padjust＜0.01）
　　 7.rs4784165(TOX3)位點(diǎn)各基因型組間mFG評(píng)分存在顯著差異，GG組評(píng)分低于另外兩組(P＜0.01)。
　　 8.rs2059807(INSR)位點(diǎn)從基因型組OGTT后2小時(shí)血糖水平高于GG+AG組(P=0.03)，結(jié)果在

19、較正年齡和BMI后仍有意義（Padjust=0.042）。
　　 9.rs6022786（SUMO1P1）位點(diǎn)各基因型組間血清T水平存在差異(P＜0.01)，GG和GA組T濃度顯著高于AA組。
　　 結(jié)論:
　　 THADA、FSHR、TOX3、SUMO1P1基因與PCOS高雄表型相關(guān)，且THADA以及DENND1A、C9orf3、HMGA2、INS基因與PCOS糖脂代謝異常也存在相關(guān)性。這些基因可能在PCOS病

20、理生理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　 第三部分：基于單一表型人群的PCOS易感基因基因型-表型關(guān)聯(lián)性分析
　　 背景:
　　 多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種復(fù)雜的遺傳性疾病，具有明顯的種族差異性和臨床異質(zhì)性。前期對(duì)中國(guó)PCOS患者的全基因組關(guān)聯(lián)性研究(GWAS)共發(fā)現(xiàn)位于11個(gè)基因座的15個(gè)寡核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(PCOS-SNPs)與PCOS易感性相關(guān)。其中2p16.3(rs13405728)、2p21(rs13429

21、458、rs12478601)和9q33.3(rs10818854、rs2479106)為一期GWAS(GWASⅠ)發(fā)現(xiàn)，并在歐洲和美國(guó)高加索人群中得到驗(yàn)證。所提示基因包括LHCGR、THADA和DENND1A。但考慮到作為一種影響廣泛的復(fù)雜性綜合征，其致病基因應(yīng)該不僅限于上述三個(gè)。因此隨后二期GWAS(GWASⅡ)又進(jìn)一步擴(kuò)大了樣本量，結(jié)果除驗(yàn)證了GWASⅠ外又發(fā)現(xiàn)了八個(gè)新的PCOS易感位點(diǎn):9q22.32(rs4385527、rs3

22、802457)、11q22.1(rs1894116)、12q13.2(rs705702)、12q14.3(rs2272046)、16q12.1(rs4784165)、19p13.3(rs2059807)、20q13.2(rs6022786)以及2p16.3(rs2268361、rs2349415)。所提示基因包括:FSHR、C9orf、YAP1、RAB5B、HMGA2、TOX3、INSR及SUMO1P1。
　　 如前所述，PCO

23、S表型多樣。大量家系研究表明PCOS的臨床特點(diǎn)多具有家族聚集性，患者一級(jí)親屬中胰島素抵抗、糖耐量異常及糖尿病發(fā)生率明顯增加。其母親及姐妹血清雄激素水平也高于一般女性，而LH反應(yīng)卻有所下降。與同年齡的正常對(duì)照女性相比，患者的女兒在青春期前血清胰島素、LH、T及17-羥孕酮水平更高，卵巢體積也更大;并且這種異常在青春期持續(xù)存在。由此可見(jiàn)，遺傳因素可能參與了PCOS表型的形成。但對(duì)于易感基因和表型發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的直接相關(guān)性卻尚無(wú)確切證據(jù)，究竟這

24、些表型受哪一個(gè)或哪幾個(gè)基因的調(diào)控一直是PCOS病因?qū)W研究的關(guān)注點(diǎn)?；诖耍静糠盅芯窟x取了三組單一表型人群，即分別具有稀發(fā)/無(wú)排卵(OA)、高雄激素(HA)、卵巢多囊樣改變(PCO)三者之一，與無(wú)任何上述表型的嚴(yán)格對(duì)照人群進(jìn)行病例對(duì)照研究，以期分離各表型，排除三種表型間的相互影響，確定易感基因與表型之間的獨(dú)立聯(lián)系，明確這些PCOS易感基因?qū)δ膫€(gè)特征性表型貢獻(xiàn)更大。
　　 目的:
　　 本研究旨在比較單一表型人群和嚴(yán)格對(duì)照

25、間PCOS-SNP等位基因頻率的差異，確定這些位點(diǎn)與特征性表型發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性，以期為下一步易感基因功能學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 本研究共納入三組單一表型人群，其中OA組746例，HA組278例，PCO組536例。對(duì)照組為1790例無(wú)任何陽(yáng)性表型的健康女性。提取所有受試者全血DNA，通過(guò)直接測(cè)序的方法檢測(cè)15個(gè)PCOS-SNPs的基因型，并分析其與PCOS表型間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:

26、　　 1.LHCGR(rs13405728)、C9orf3(rs4385527)和INSR(rs2059807)基因與OA存在顯著相關(guān)性，結(jié)果在較正年齡和BMI后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Padjust分別為9.47E-03、4.40E-09、3.18E-02)。
　　 2.C9orf3(rs4385527)與HA顯著相關(guān)，結(jié)果獨(dú)立于年齡和BMI(Padjust=1.77E-04)。
　　 3.THADA(rs13429458、

27、rs12478601)、DENND1A(rs10818854)以及C9orf3(rs4385527)與PCO顯著相關(guān)，結(jié)果在較正年齡和BMI后同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Padjust分別為1.47E-03、6.38E-04、1.73E-02和2.20E-07)。
　　 結(jié)論:
　　 部分PCOS易感基因與其特征性臨床表型有直接相關(guān)性。其中LHCGR和INSR與OA表型相關(guān)，THADA和ENND1A與PCO表型相關(guān)，而C9orf3