多囊卵巢綜合征易感基因相關(guān)研究.pdf

1、第一章 GWAS新易感區(qū)域在多囊卵巢綜合征家系中的研究
　　背景：多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是一種存在高度遺傳異質(zhì)性的復(fù)雜性疾病。繼第一期GWAS研究后，第二期GWAS研究發(fā)現(xiàn)了8個(gè)新易感區(qū)域。為了排除人群分層偏倚等因素的干擾，本研究對(duì)8個(gè)易感區(qū)域進(jìn)行基于家系的關(guān)聯(lián)性分析，以進(jìn)一步驗(yàn)證前期GWAS發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)與該疾病的關(guān)聯(lián)性。
　　方法：共納入321組核心家系（由先證者與

2、其生物學(xué)父母組成，共計(jì)963例）為研究對(duì)象。應(yīng)用Sequenom MassArray對(duì)8個(gè)易感區(qū)域內(nèi)最顯著關(guān)聯(lián)的10個(gè)SNPs進(jìn)行基因型分析。然后對(duì)各SNP位點(diǎn)進(jìn)行基于家系的傳遞不平衡檢驗(yàn)(Transmission disequilibrium test，TDT)等。
　　結(jié)果：經(jīng)TDT分析，rs2349415位點(diǎn)的C等位基因（FSHR；TDTχ2=14.76，P=0.0001），rs3802457位點(diǎn)的C等位基因（C9orf3；

3、TDTχ2=14.42，P=0.0001）以及rs2272046位點(diǎn)的T等位基因（HMGA2；TDTχ2=4.457，P=0.035），均存在顯著的傳遞不平衡。rs4784165位點(diǎn)的T等位基因（TOX3；TDTχ2=3.846，P=0.050）表現(xiàn)出一定程度的傳遞不平衡。其他6個(gè)SNP位點(diǎn)雖然未到達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均存在過度傳遞現(xiàn)象。經(jīng)多重檢驗(yàn)校正后，rs2349415（FSHR；P=0.0036）和rs3802457（C9orf3；P

4、=0.0046）依然存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：rs2349415和rs3802457位點(diǎn)在PCOS家系發(fā)生明顯的傳遞不平衡，該位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的區(qū)域2p16.3和9q22.32確為PCOS的易感區(qū)域，其對(duì)應(yīng)基因如FSHR和C9orf3在該疾病中的作用機(jī)制有待深入研究。第二章 MicroRNA601在多囊卵巢綜合征發(fā)病中的作用機(jī)制研究
　　背景：多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）以

5、稀發(fā)/無排卵、高雄激素和胰島素抵抗為主要特征，在中國(guó)的發(fā)病率為5.6％。鑒于該疾病的高度遺傳異質(zhì)性，本課題組先前利用GWAS技術(shù)報(bào)道了PCOS的11個(gè)易感區(qū)域，其中9q33.3區(qū)域是在不同人群中得到最廣泛驗(yàn)證的，該區(qū)域所對(duì)應(yīng)的候選基因?yàn)镈ENND1A，而在DENND1A近3’端的內(nèi)含子區(qū)有一個(gè)microRNA，名為MIR601（miR-601）。目前為止，關(guān)于GWAS易感區(qū)域內(nèi)非編碼序列的研究非常少。因此本研究擬探討 miR-601在P

6、COS患者中的表達(dá)特征及其在PCOS發(fā)病中的作用及其機(jī)制。
　　方法：用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-601在PCOS患者外周血及顆粒細(xì)胞中表達(dá)變化，并與臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。然后利用卵巢膜間質(zhì)細(xì)胞和顆粒細(xì)胞體外單獨(dú)培養(yǎng)的系統(tǒng)，研究miR-601對(duì)甾體激素合成的影響，并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，用免疫共沉淀等技術(shù)，尋找miR-601的靶基因，利用熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)驗(yàn)證的靶基因，通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染、激動(dòng)劑/抑制劑等處理，用R

7、T-PCR、Western blot等驗(yàn)證其靶基因的變化在介導(dǎo)激素合成中的作用。
　　結(jié)果：miR-601在PCOS患者血和顆粒細(xì)胞中表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01），且其表達(dá)分別與LH、T、E2以及AMH相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIRT1為miR-601調(diào)控的靶基因，且SIRT1在PCOS患者外周血表達(dá)下降。miR-601異?？赏ㄟ^其靶基因來調(diào)節(jié)激素合成相關(guān)基因的表達(dá)，使得卵巢膜間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成顯著增加，對(duì)顆粒細(xì)胞雌激素影響不顯著。S

8、IRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇可以使卵巢膜間質(zhì)細(xì)胞雄激素合成減少，可拮抗miRNA的作用。
　　結(jié)論：源于PCOS GWAS易感區(qū)域的非編碼序列miR-601通過其靶基因如SIRT1促進(jìn)雄激素合成，進(jìn)而介導(dǎo)PCOS患者的高雄激素的發(fā)生。PCOS GWAS易感區(qū)域內(nèi)的非編碼序列在疾病中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　第三章 USP34基因與多囊卵巢綜合征的相關(guān)性研究
　　背景：多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndro

9、me，PCOS）是一種多因性疾病，遺傳因素參與該疾病的發(fā)生。前期全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)許多與疾病關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，在基因USP34區(qū)域有一系列SNP因其P值接近但未達(dá)到GWAS嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求而未被報(bào)道。本研究將選取該區(qū)域的SNP位點(diǎn)在獨(dú)立于GWAS的樣本中進(jìn)行擴(kuò)大驗(yàn)證。
　　方法：納入1218例PCOS患者和1057例對(duì)照，選取USP34基因區(qū)的2個(gè)SNP(rs17008097和rs17008940)，用TaqMan-MGB探針法進(jìn)行基

10、因分型分析。
　　結(jié)果：即使校正年齡和BMI，rs17008097和rs17008940的等位基因頻率和基因型頻率在病例和對(duì)照組之間沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在PCOS患者中，按基因型分類分析臨床和代謝指標(biāo)（LH、T、HOMA-IR），未發(fā)現(xiàn)明顯差異。但在PCOS組rs17008940與BMI有一定的關(guān)聯(lián)，校正年齡后，這種關(guān)聯(lián)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(TC vs CC P=0.006,OR=1.042,95%CI1.012-1.073;TT v