喉鱗癌患者樹突狀細(xì)胞（DCs）功能及Hep-2總RNA轉(zhuǎn)染DCs抗喉癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究背景與目的]: 喉癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率處于耳鼻咽喉各部分惡性腫瘤的第三位。在喉癌的病理類型中，以喉鱗癌最為常見，一般占全部喉惡性腫瘤的95～99％。目前喉癌的治療以手術(shù)、放療及化療為主。近年來，雖然手術(shù)、放化療技術(shù)發(fā)展迅速，但喉鱗癌患者特別是晚期患者的的長期生存率在過去10年中未見明顯提高。因此，進(jìn)一步改善喉癌患者預(yù)后的研究勢在必行。 以往的研究證實(shí)，抗腫瘤免疫在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中有重要作用。機(jī)

2、體的抗腫瘤免疫應(yīng)答是以T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答為主。在此過程中，首先由抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)捕獲、加工處理抗原并將抗原信息傳遞給T淋巴細(xì)胞，才能進(jìn)而引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的APC，能在體內(nèi)外直接激活初始T細(xì)胞(naive T cell)，促進(jìn)輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生成，同時(shí)也能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞生

3、成抗體，是啟動(dòng)、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。 由于DC在體內(nèi)免疫應(yīng)答中重要而獨(dú)特的作用，近年來，以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療研究越來越受到關(guān)注。已有研究證實(shí)，通過體外細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)擴(kuò)增DC，模擬DC體內(nèi)成熟過程，以不同形式的抗原物質(zhì)，如人工合成腫瘤多肽、腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物、腫瘤蛋白抗原、凋亡腫瘤細(xì)胞、DNA或RNA負(fù)載DC，再將致敏DC回輸體內(nèi)作為疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞應(yīng)用于抗喉鱗癌的研究尚處于初級(jí)階

4、段。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)喉癌腫瘤特異性抗原，因此腫瘤全抗原成為制備疫苗的主要手段。已有報(bào)道應(yīng)用喉癌細(xì)胞裂解產(chǎn)物負(fù)載樹突狀細(xì)胞或用電融合的方法制備疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。最近研究發(fā)現(xiàn)，以RNA負(fù)載DC能夠引發(fā)更為強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，而且已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其優(yōu)越的安全性及廣闊的應(yīng)用前景。但以RNA負(fù)載DC的抗喉鱗癌研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。另外，樹突狀細(xì)胞免疫學(xué)功能的強(qiáng)弱取決于DC的免疫狀態(tài)。眾所周知，腫瘤患者的DC存在缺陷，但由于T細(xì)胞活化的

5、MHC限制性，臨床上應(yīng)用DC誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答必須使用腫瘤患者自身的DC，因而研究惡性腫瘤患者DC的數(shù)目及功能顯得尤為重要。另一方面，雖然DC為基礎(chǔ)的免疫治療有其獨(dú)特的優(yōu)勢，但近期內(nèi)仍無法作為主要的臨床治療手段。對(duì)于喉鱗癌患者，手術(shù)及放療仍然不失為目前最有效的治療方法。因此研究喉鱗癌患者DC免疫狀態(tài)，除了考慮疾病本身對(duì)DC的影響，尚需考慮目前常規(guī)治療方法對(duì)DC的影響。 本研究檢測手術(shù)及術(shù)后輔助放療對(duì)喉癌患者外周血循環(huán)DC亞型及外

6、周血單核細(xì)胞來源DC(monocyte-derived DCs，MoDCs)功能的影響，以探討喉癌免疫治療的時(shí)機(jī)；同時(shí)，以EGFP標(biāo)記的喉癌Hep-2株總：RNA轉(zhuǎn)染MoDCs，研究其誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的能力及對(duì)喉鱗癌的特異性殺傷效應(yīng)，為臨床以DC為基礎(chǔ)的抗喉癌治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 第一部分 健康人外周血樹突狀細(xì)胞亞型檢測及培養(yǎng)、鑒

7、定 [目的] 建立簡便可靠的外周血樹突狀細(xì)胞亞型檢測方法，培養(yǎng)鑒定外周血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞。 [方法] 采集15例健康人外周血，采用三色流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測外周血HLA-DR+lineage-樹突狀細(xì)胞及其亞型。myeloid DC(mDC)、plasmacytoid DC(pDC)在外周血WBC所占百分比并計(jì)算其絕對(duì)數(shù)。采用淋巴細(xì)胞分離液自外周血分離獲得單核細(xì)胞，體外經(jīng)人重組細(xì)胞因子GM-CSF、IL

8、-4和FNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得成熟外周血單核細(xì)胞來源DC倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài)，透射電鏡觀察DC超微結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測其表型，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖的能力。 [結(jié)果] 健康人LIN-DR+細(xì)胞在WBC中所占百分比為0.41±0.13％，絕對(duì)數(shù)為22.75+5.22/μl，mDC在WBC中所占百分比為0.28±0.13％，絕對(duì)數(shù)為15.12+4.66/μl，pDC在WBC中所占百分比為0.

9、068±0.032％，絕對(duì)數(shù)為3.78±1.40/μl；培養(yǎng)獲得具有典型形態(tài)特征的外周血單核細(xì)胞來源DC；健康人LIN陰性細(xì)胞中，共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)陽性細(xì)胞所占百分比分別為46.5±7.1％和51.1±9.6％，同時(shí)多數(shù)DC表達(dá)DC成熟標(biāo)志CD83和HLA-DR，陽性細(xì)胞百分比分別為62.6±10.3％和7.34±8.1％，表明單核細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后大部分分化為成熟DC；證實(shí)少量DC即可刺激自體淋巴細(xì)

10、胞產(chǎn)生較強(qiáng)的增殖效應(yīng)。 [結(jié)論]流式細(xì)胞儀檢測外周血DC亞群簡便、可靠；聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α能夠自外周血中成功分離、誘導(dǎo)培養(yǎng)具有典型形態(tài)特征及功能活性的單核細(xì)胞來源DC。 　第二部分手術(shù)及術(shù)后放療對(duì)喉鱗癌患者外周血樹突狀細(xì)胞亞型及功能的影響 [目的]研究手術(shù)及術(shù)后輔助放療對(duì)喉鱗癌患者外周血樹突狀細(xì)胞亞型及外周血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞功能的影響。 [方法]采集46例經(jīng)病理證實(shí)的

11、喉鱗癌患者及15例健康志愿者外周血。46名喉鱗癌患者中男性44例，女性2例，年齡分布為32～76歲，平均年齡為57.57+10.09歲。根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期14例，Ⅱ期8例，Ⅲ期11例，Ⅳ期13例。46例患者入院后均接受手術(shù)治療，28例患者手術(shù)后接受頸部直線加速器放射治療。接受單純手術(shù)治療的患者(n=18)及接受手術(shù)+放療的患者(n=28)均于治療前、治療中及治療后分三次采集外周血標(biāo)本。采用三

12、色流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測外周血HLA-DR+lineage-樹突狀細(xì)胞及其亞型mDC、pDC在外周血WBC所占百分比并計(jì)算其絕對(duì)數(shù)。采用淋巴細(xì)胞分離液自外周血分離獲得單核細(xì)胞，體外經(jīng)人重組細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4和FNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得外周血單核細(xì)胞來源DC，流式細(xì)胞儀檢測其表型，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖的能力。 [結(jié)果]治療前喉鱗癌患者外周血mDC計(jì)數(shù)、MoDC表面分子表達(dá)及刺激自體T淋巴細(xì)胞增

13、殖能力均低于健康人；經(jīng)手術(shù)治療后，接受輔助放療和未接受輔助放療的患者其mDC計(jì)數(shù)、MoDC表面分子CD80，CD83，HLA-DR的表達(dá)均明顯高于治療前，但僅在術(shù)后未接受輔助放療的患者中觀察到CD86表達(dá)及刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖能力的恢復(fù)。 [結(jié)論]喉鱗癌患者DC存在缺陷；手術(shù)治療可提高喉鱗癌患者外周血mDC計(jì)數(shù)及MoDC的功能；術(shù)后輔助放療不影響外周血mDC計(jì)數(shù)的正?；珜?duì)MoDC功能具有抑制作用。 第三部分以EGF

14、P標(biāo)記的喉癌Hep-2細(xì)胞株總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞的特異性抗喉癌實(shí)驗(yàn)研究 [目的]探討以EGFP為標(biāo)記觀察喉鱗癌Hep-2細(xì)胞株總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞的可行性；探討轉(zhuǎn)染后DC誘導(dǎo)特異性識(shí)別Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的可能性及特異性殺傷效應(yīng)。 [方法]采用淋巴細(xì)胞分離液自健康人外周血分離獲得單核細(xì)胞，體外經(jīng)人重組細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得未成熟DC，觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其表型；培養(yǎng)喉癌H

15、ep-2細(xì)胞株，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染至Hep-2細(xì)胞株，通過G418篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞株；Trizol一步法提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞株總RNA，檢測其完整性及純度；以共孵育及電穿孔法將RNA導(dǎo)入未成熟DC，并以TNF-α促成熟；應(yīng)用熒光顯微鏡觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率；通過流式細(xì)胞技術(shù)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測RNA轉(zhuǎn)染后對(duì)DC表型、刺激T細(xì)胞增殖能力的影響；將轉(zhuǎn)染后DC與同種異體T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)

16、7天，收集效應(yīng)細(xì)胞作為特異性CTL，通過51Cr釋放法檢測其對(duì)Hep-2細(xì)胞株的特異性殺傷效應(yīng)。 [結(jié)果]pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選可獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞株，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，經(jīng)20次傳代后熒光仍無消失，Hep-2細(xì)胞形態(tài)及生長特性未見明顯改變；經(jīng)Trizol一步法提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞株總RNA 80～100～μg/107細(xì)胞，分光光度法測定OD260/OD280=1.83

17、，RNA電泳顯示18S、28S條帶，證實(shí)RNA的完整性；共孵育及電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率分別為7～9％和21～23％；RNA導(dǎo)入未成熟DC后，細(xì)胞表達(dá)綠色熒光持續(xù)20～24小時(shí)；Hep-2-EGFP-RNA轉(zhuǎn)染組DC表面分子CD83、HLA-DR表達(dá)較轉(zhuǎn)染前及對(duì)照轉(zhuǎn)染組顯著升高，陽性細(xì)胞百分比達(dá)89.5％、95.4％，刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力顯著提高；Hep-2-EGFP-RNA轉(zhuǎn)染組DC體外誘導(dǎo)的CTLs可特異性殺傷喉癌Hep-2