DDAH2基因修飾EPC加速裸大鼠球囊損傷后再內(nèi)皮化進(jìn)程的研究.pdf

1、研究背景:冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)功能降低是影響支架植入后內(nèi)皮修復(fù)和導(dǎo)致再狹窄的重要原因。近期發(fā)現(xiàn)冠心病患者內(nèi)源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制物非對(duì)稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)增高與EPCs功能降低密切相關(guān)，二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylarginine dime

2、thylaminohydrolase，DDAH)是體內(nèi)代謝ADMA的關(guān)鍵酶，它在與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的疾病中功能降低而導(dǎo)致ADMA增高，兩者的消長(zhǎng)密切影響心血管系統(tǒng)的功能狀態(tài)。本項(xiàng)目擬構(gòu)建DDAH2基因過表達(dá)的EPCs，觀察DDAH2基因過表達(dá)對(duì)EPCs功能的影響。并在球囊損傷的裸大鼠模型上，進(jìn)一步觀察移植DDAH2基因過表達(dá)的hEPCs對(duì)血管的再內(nèi)皮化及內(nèi)膜增生的影響。探討DDAH/ADMA系統(tǒng)與EPCs功能改變之間的關(guān)系。本研究將有助

3、于揭示EPCs功能損傷的機(jī)制，并為再狹窄的防治提供新的思路。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分:
　　(1) EPCs分離與鑒定:采用密度梯度離心法分離人臍血的單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)至第10天，采用乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)與荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)雙染鑒定，以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)分子標(biāo)志CD133，CD34和vWF以進(jìn)一步鑒定是否為EPCs。
　　(2) DDAH2基因過表達(dá)對(duì)EPCs功能的影響:其中DDA

4、H基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司協(xié)助完成;采用熒光法以及RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，檢測(cè)EPCs對(duì)人纖維粘接蛋白以及內(nèi)皮細(xì)胞的黏附功能。采用改良的Boyden小室，檢測(cè)EPCs的遷移能力。
　　(3) DDAH2基因過表達(dá)EPCs對(duì)裸大鼠球囊損傷后再內(nèi)皮化進(jìn)程以及內(nèi)膜增生的影響。采用伊文思蘭染色檢測(cè)再內(nèi)皮化;采用HE染色檢測(cè)內(nèi)膜增生。
　　結(jié)果:
　　(1) DDAH2過表達(dá)EP

5、Cs對(duì)人纖維連接蛋白(FN)的黏附能力顯著增強(qiáng)，與對(duì)照組比較，P＜0.01，而轉(zhuǎn)染非目的基因的EPCs(NonT-EPCs)對(duì)人纖維連接蛋白的黏附作用無明顯增強(qiáng);DDAH2過表達(dá)EPCs顯著增加TNF-α誘導(dǎo)的EPCs-內(nèi)皮細(xì)胞黏附，與對(duì)照組比較，P＜0.01，而轉(zhuǎn)染非目的基因的EPCs(Non T-EPCs)無類似作用。
　　(2)過表達(dá)DDAH2顯著增強(qiáng)了SDF-1誘導(dǎo)的EPCs遷移能力，與對(duì)照組比較，P＜0.01，而轉(zhuǎn)染非目

6、的基因的EPCs(Non T-EPCs)無類似作用。
　　(3)在球囊損傷后移植DDAH2過表達(dá)的EPCs顯著增加再內(nèi)皮化率，與對(duì)照組（局部注射PBS液）相比，P＜0.01。
　　(4)移植過表達(dá)DDAH2的EPCs后，可顯著抑制裸大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生，對(duì)照組（局部注射PBS液）相比，P＜0.01。
　　結(jié)論:(1)首次證實(shí)DDAH2過表達(dá)的EPCs黏附和遷移能力顯著增強(qiáng);(2)成功構(gòu)建裸大鼠球囊損傷模型，并