蛇根木異胡豆苷糖苷酶及Vinorine合成酶表達、純化、抑制劑抑制機理和復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、蛇根木(Rauvolfia serpentina Benth.ex Kurz)為夾竹桃科蘿芙木屬藥用植物，其藥用部位根含有90余種生物堿，主要活性成分包括阿嗎靈、阿嗎堿、利血平、瑞西那明和地舍平，有抗心律失常、降血壓、鎮(zhèn)靜和止痛等作用。研究該次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑是我們準確了解生物合成機理以及調(diào)控代謝方向、體外異源表達活性成分和酶修飾等的前提。本論文對參與阿嗎靈生物合成途徑中重要的異胡豆苷糖苷酶(Strictosidine-O-bet

2、a-D-glucosidase，SG)和Vinorine合成酶(VinorineSynthase，VS)進行了系列研究，主要包括酶表達、純化、復(fù)合物結(jié)晶、三維結(jié)構(gòu)表征及抑制劑抑制機理等研究。
　　 課題組在前期對異胡豆苷糖苷酶的生物化學(xué)以及單晶的三維結(jié)構(gòu)進行了研究，通過序列比對和相關(guān)驗證得出其為糖苷水解酶家族成員(Glycoside hydrolase，GH)。發(fā)現(xiàn)及合成潛在糖苷酶抑制劑具有重要的意義，如在人體糖尿病治療，溶酶體

3、存儲紊亂或是病毒感染以及抑制這些糖苷酶會對代謝等產(chǎn)生重要影響。
　　 本文第一部分對近年來引起廣泛興趣的糖苷酶抑制劑進行了基于酶三維結(jié)構(gòu)和原子水平上的抑制機理分析與闡釋。摸索相關(guān)糖苷酶與不同抑制劑復(fù)合物的結(jié)晶條件，采用氣相擴散懸滴法進行結(jié)晶，底物浸泡法獲取酶與抑制劑的復(fù)合物，對所搜集數(shù)據(jù)進行分析處理，獲得酶與抑制劑的三維結(jié)構(gòu)，闡明不同抑制劑的抑制機理。為進一步抑制劑的設(shè)計與化學(xué)合成提供結(jié)構(gòu)上的重要信息，同時，也能為酶結(jié)構(gòu)修飾改變

4、其底物特異性提供新型高效的生物催化劑奠定理論基礎(chǔ)。
　　 VS酶是BAHD家族中第一個得到三維結(jié)構(gòu)的酶，但其結(jié)合、活性位點及催化機理尚不確定，因此對VS酶與其底物或輔因子等的復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)解析顯得尤為重要。本論文采用突變法及重新篩選新結(jié)晶條件等手段嘗試獲取復(fù)合物單晶，并搜集了衍射數(shù)據(jù)，經(jīng)初步處理得到了不同于先前結(jié)構(gòu)的晶胞構(gòu)型。高通量篩選發(fā)現(xiàn)了三個不同的苗頭結(jié)晶條件，是接下來優(yōu)化及獲得適合X-射線衍射的復(fù)合物單晶的前提條件。