Musashi-2與AML臨床預(yù)后關(guān)系及在Hl-60細(xì)胞生物學(xué)中的作用研究.pdf

1、目的：通過檢測AML初診患者M(jìn)si2 mRNA表達(dá)，結(jié)合患者隨訪，采用獨立樣本t檢驗分析Msi2表達(dá)與AML和AML預(yù)后的關(guān)系，探討其是否是一個較佳的早期預(yù)后指標(biāo)。采用基因工程方法，構(gòu)建Msi2-pIRES2-EGFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人髓系白血病HL-60細(xì)胞株，觀察Musashi-2對HL-60細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。
　　方法：(1)提取臨床初診確診為AML的患者和按時隨訪的AML患者的骨髓標(biāo)本的總RNA，熒光定量RT-PCR檢測

2、患者M(jìn)si2的表達(dá)水平，綜合分析其它實驗室檢查和患者的臨床表現(xiàn)，結(jié)合患者隨訪，分析Msi2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，探討是否是一個較佳的預(yù)后早期預(yù)測指標(biāo)；(2)從HL-60細(xì)胞株中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出Msi2模板基因，酶切后插入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP得到Msi2-pIRES2-EGFP重組真核表達(dá)載體，酶切后測序鑒定。測序鑒定成功后經(jīng)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，熒光

3、定量RT-PCR和蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Msi2mRNA和蛋白表達(dá)；(3)用LipofectamineTM LTX轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞株，72小時后熒光定量RT-PCR和Western blot檢測Msi2 mRNA和蛋白表達(dá)，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力的改變。
　　結(jié)果：(1)初診AML患者骨髓Msi2表達(dá)顯著高于正常對照骨髓(P<0.05)，各亞型中Msi2表達(dá)以

4、M1和M5表達(dá)為高，顯著高于AML其它亞型(P<0.05)；(2)AML患者中Msi2表達(dá)高者預(yù)后差(P<0.01)(3)酶切及測序結(jié)果證實Msi2-pIRES2-EGFP重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功；(4)將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞，72小時后收集總RNA和蛋白，熒光定量RT-PCR和Western blot都證實重組質(zhì)粒在基因和蛋白水平都能有效表達(dá)；(5)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HL-60細(xì)胞Msi2表達(dá)較對照組和空質(zhì)粒組有顯著增加(P<

5、0.01)(6)MTT法檢測細(xì)胞增殖能力顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HL-60細(xì)胞較對照組和空質(zhì)粒組其增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)。
　　結(jié)論：(1)人AML初診患者M(jìn)si2表達(dá)顯著高于正常人，且M1和M5亞型顯著高于其它亞型；(2)Msi2表達(dá)高的患者預(yù)后不良；(3)成功構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體Msi2-pIRES2-EGFP，并轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞，成功檢測到Msi2基因和蛋白表達(dá)；(4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞后導(dǎo)致Msi2基因過表