HIV新發(fā)-急性感染者不同亞群T細胞BTLA表達與疾病進展關系研究.pdf

1、目的:B、T淋巴細胞衰減因子(BTLA)是繼PD-1、CTLA-4后，免疫球蛋白超家族發(fā)現(xiàn)的第三個抑制性分子，作為新近發(fā)現(xiàn)的抑制性受體，日益受到關注。BTLA表達于外周血成熟淋巴細胞，脾臟巨噬細胞和髓系樹突狀細胞(DCs)，在NK細胞上低表達，行使負性免疫調(diào)節(jié)功能，其配體為腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)的成員HVEM(HVEM)，兩者結(jié)合屬于跨家族結(jié)合。體外實驗表明BTLA對T細胞活化、增殖具有負性調(diào)節(jié)作用，可以抑制CD3誘導的

2、T細胞增殖以及IL-2，IL-10，IFN-γ的分泌。動物實驗顯示，BTLA缺陷小鼠易發(fā)生自身免疫性疾病，小鼠實驗性自身免疫腦脊髓膜炎模型中，BTLA缺陷小鼠發(fā)病率高，病情嚴重，移植排斥反應中，BTLA缺陷小鼠比野生型小鼠更易于排斥MHCⅡ不匹配的心臟移植，提示BTLA可以通過對T細胞有效的抑制在控制效應細胞應答中發(fā)揮重要作用。
　　 HIV感染可導致免疫系統(tǒng)持續(xù)免疫活化及功能耗竭，共抑制分子如PD-1，CTLA-4在HIV感染

3、過程中發(fā)揮著重要作用，這些共信號分子途徑在T細胞分化及T細胞應答中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)功能，從而維持機體免疫反應處于穩(wěn)態(tài)。最近已有研究證實免疫負性調(diào)節(jié)分子BTLA在T細胞免疫耐受中發(fā)揮重要作用，并且影響T細胞活化和T細胞功能，與自身免疫性疾病的發(fā)生與疾病進程相關。那么BTLA是否像CTLA-4，PD-1等共抑制分子一樣在HIV感染中發(fā)揮作用?徐向升等人發(fā)現(xiàn)，HIV慢性感染者CD4+、CD8+T細胞上BTLA表達隨著疾病進展明顯下降。但BTL

4、A在不同亞群T淋巴細胞表達，特別是HIV新發(fā)感染者中如何表達國內(nèi)外尚無報道。
　　 研究表明，宿主在HIV新發(fā)感染期產(chǎn)生的抗病毒免疫應答對最終的疾病進程起了決定性的作用。殺傷性T淋巴細胞(CTL)為限制病毒在體內(nèi)復制的主要宿主免疫因子，通過作用于病毒感染細胞，在抗病毒防御機制中發(fā)揮重要作用。對HIV新發(fā)感染期免疫系統(tǒng)與HIV相互作用的研究，對于了解宿主控制病毒的防御機制至關重要。由于HIV新發(fā)/急性感染者樣本較難獲得，目前對這一

5、時期的研究較少。本實驗室建立了男男性接觸感染者高危人群隊列，通過定期隨訪獲得了HIV新發(fā)/急性感染者樣本，本研究首次對我國HIV新發(fā)/急性感染者不同亞群純真及記憶型T淋巴細胞BTLA表達水平與疾病進展相關性進行了研究，并與HIV慢性感染者及正常對照進行對比，為闡明BTLA在HIV感染中發(fā)揮的作用及免疫治療提供線索。
　　 方法:
　　 1、研究對象
　　 50例未接受抗病毒治療的HIV感染者來自遼寧、黑龍江、吉林

6、等地，男性46名，女性4名，年齡分布為20-76(33±11.23)歲。其中包括21例HIV新發(fā)/急性感染者（Primary/Acute HIV infection，PHI/AHI組），入選標準為抗體陽轉(zhuǎn)在一年以內(nèi)，檢測時間為50.10±4.19天；29例慢性HIV感染者（chronic HIV infection，CHI組），HIV感染時間1年以上；23例健康對照（normal control，NC組）為隨機抽取的HIV抗體陰性、未暴

7、露于HIV的健康人，均為男性，符合以下標準：HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病。
　　 2、T細胞亞群BTLA表達水平及活化水平檢測
　　 取HIV-1感染者全血，應用以下熒光標記的單抗進行染色：CD4-APC-cy7/CD8-Percp/CD3-PE-cy7/ CD45RA-FITC/BTLA-PE;CD4-APC-Cy7/CD8-FITC/CD3-PE-cy7/H

8、LA-DR-Percp/CD38-PE及相應同型對照。樣品于室溫避光染色30min。加入溶血素3毫升，室溫避光，離心，棄上清。加入PBS洗滌，以含1％多聚甲醛的PBS(PBS)重懸，F(xiàn)ACS Aria流式細胞儀檢測FlowJo軟件進行分析。以FSC、SSC、CD3定義T淋巴細胞，分析CD4+、CD8+、CD45RA+或CD45RA-CD4+、CD8+T細胞表面BTLA表達水平。同時分析CD4+、CD8+T細胞表面HLA-DR+、CD38

9、+表達水平。
　　 3、CD4+T細胞絕對值及病毒載量檢測
　　 T細胞絕對值檢測采用單平臺法，應用BD公司TruCOUNT管，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀檢測，MULTISET軟件分析結(jié)果。病毒載量采用RT-PCR方法，用美國Roche公司的COBAS AMPLICOR自動載量儀測定病毒載量。
　　 4、統(tǒng)計學分析
　　 用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計學分析。應用Mann-Whitney U t

10、est進行組間T細胞亞群BTLA表達水平的比較。T細胞亞群BTLA表達與CD4+T細胞、病毒載量、淋巴細胞活化水平的相關性應用Spearman相關進行計算。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、HIV新發(fā)/急性感染者T細胞亞群BTLA表達水平
　　 1、 HIV新發(fā)/急性感染組各亞群T細胞BTLA表達水平高于正常對照，其中memory CD4+、memory CD8+、總CD4+T細胞BTL

11、A表達水平在兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 2、 HIV新發(fā)/急性感染組各亞群T細胞BTLA表達水平高于慢性感染者，除memory CD8+T細胞外，其它亞群T細胞BTLA表達水平在兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 二、HIV感染者不同亞群T細胞BTLA表達水平與淋巴細胞活化水平相關性HIV感染者各亞群T細胞BTLA表達水平與T細胞活化水平負相關
　　 1、各亞群T細胞BTLA表達百分率與T細胞活化(CD4

12、+HLA-DR+T細胞表達)水平明顯負相關；
　　 2、na(i)ve CD8+T細胞BTLA表達水平與CD4+CD38+T細胞表達明顯負相關;
　　 3、na(i)ve CD4+、naive CD8+、總CD4+T細胞BTLA表達水平與CD8+HLA-DR+T細胞表達明顯負相關。
　　 三、HIV感染者不同亞群T細胞BTLA表達水平與CD4、病毒載量相關性
　　 HIV感染者na(i)ve CD8+、m