不同分子質(zhì)量海帶苔藻聚糖硫酸酯抗血栓活性及機(jī)理研究.pdf

1、巖藻聚糖硫酸酯是一種富含硫酸基團(tuán)的陰離子多糖,主要來(lái)源于褐藻、海參和海膽等。因其具有抗凝血、抗病毒、抗腫瘤、抑制血管增殖以及抗氧化等多種生物學(xué)活性,成為當(dāng)今海洋功能性食品和藥物研究的熱點(diǎn)。
　　體外研究表明,不同來(lái)源的大分子巖藻聚糖硫酸酯均具有良好的抗血栓活性。但由于這些大分子巖藻聚糖硫酸酯一般分子組成復(fù)雜,溶解性低,吸收較差。若直接注射又會(huì)產(chǎn)生較大的毒性,進(jìn)入體內(nèi)后副作用較大,限制了其應(yīng)用。
　　近年來(lái),有報(bào)道稱(chēng)從泡葉藻中

2、提取的低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯在體內(nèi)同樣顯示出抗血栓活性。由于提取來(lái)源不同,巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)組分和結(jié)構(gòu)會(huì)有較大差異,對(duì)于從海帶中提取的低分子質(zhì)量的巖藻聚糖硫酸酯是否同樣具有抗血栓活性,還鮮有報(bào)道,亦未見(jiàn)對(duì)其抗血栓機(jī)制進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道。
　　本課題組前期應(yīng)用自由基氧化法和陰離子交換法,從海帶中制備純化了具有不同分子質(zhì)量和硫酸根含量的4種巖藻聚糖硫酸酯組分,分別為低分子質(zhì)量的巖藻聚糖硫酸酯LF1和LF2,中分子質(zhì)量的MFa和MF

3、b。本文對(duì)這4種巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行了抗血栓活性以及相關(guān)機(jī)理的研究,主要工作及結(jié)論如下:
　　1.對(duì)不同分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯的體內(nèi)抗血栓活性進(jìn)行了研究
　　首先對(duì)不同分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行急性毒性研究,并結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的藥效學(xué)結(jié)果,確定合理的給藥劑量。在此基礎(chǔ)上,采用Fecl3刺激法制作動(dòng)脈血栓模型,采用結(jié)扎法制作下腔靜脈血栓模型,對(duì)不同分子質(zhì)量和硫酸根含量的巖藻聚糖硫酸酯體內(nèi)抗血栓活性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

4、　　通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著分子質(zhì)量的增加,其毒性逐漸增強(qiáng)。其中2種LMWF的LD50相近(分別為716.0mg·kg-1和639.1 mg·kg-1),而2種MMWF的LD50相近(分別為50.6 mg·kg-1和45.1 mg·kg-1)。
　　在本實(shí)驗(yàn)中,4種巖藻聚糖硫酸酯均具有良好的抗血栓作用。且隨著分子質(zhì)量增加,其血栓濕重逐漸減少,血栓生成抑制率逐漸增加,說(shuō)明其抗血栓作用逐漸增強(qiáng)。并且這種抗血栓活性呈現(xiàn)明顯的劑量相關(guān)性

5、。
　　2.對(duì)不同分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯的內(nèi)皮保護(hù)作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　同時(shí)采用體內(nèi)研究和體外研究的方法,探討了不同分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。在體內(nèi)研究中,通過(guò)制作大鼠內(nèi)皮損傷模型,顯微鏡下觀察大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷情況,并測(cè)定內(nèi)皮損傷指標(biāo)血管性血友病因子(vWF)。在體外研究中,通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng),考察藥物對(duì)內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用,除vWF外,本文還使用內(nèi)皮微顆粒(EMPs)水平作為內(nèi)皮損傷指標(biāo)。

6、r>　　在本文中,我們發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量的巖藻聚糖硫酸酯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞均具有良好的保護(hù)作用;而中分子質(zhì)量的巖藻聚糖硫酸酯雖然對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有所改善,但這種保護(hù)作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于LMWF。同時(shí)發(fā)現(xiàn),LMWF可通過(guò)降低vWF和EMPs濃度,阻斷血小板與受損血管內(nèi)皮中的膠原結(jié)合,從而抑制了血小板活化,發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用。
　　3.考察了不同分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯對(duì)血小板系統(tǒng)的影響及其作用機(jī)制
　　通過(guò)制作大鼠血管內(nèi)皮損傷模型,考察了海帶巖藻

7、聚糖硫酸酯對(duì)血小板粘附率的影響;應(yīng)用二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和血小板活化因子(PAF)3種誘導(dǎo)劑考察了海帶巖藻聚糖硫酸酯對(duì)血小板聚集率的影響;檢測(cè)了影響血小板聚集的重要指標(biāo)TXB2和6-Keto-PGF1α和對(duì)胞漿Ca2+內(nèi)流的影響。
　　結(jié)果顯示,低分子質(zhì)量的LF1和LF2均可明顯降低血小板粘附率,而中分子質(zhì)量的MFa和MFb對(duì)血小板粘附率沒(méi)有明顯影響。LF1和LF2對(duì)由ADP、AA和PAF誘導(dǎo)的血小板聚集均具有

8、較好的抑制作用,而中分子質(zhì)量的MFa和MFb對(duì)血小板聚集不僅沒(méi)有抑制作用,反而表現(xiàn)出促進(jìn)血小板聚集的作用。4組巖藻聚糖硫酸酯均表現(xiàn)出降低TXB2的作用,其中LF1和LF2組的降低作用強(qiáng)于MFa和MFb;另外,LF1和LF2同時(shí)具有升高6-keto-PGF1α的作用,而MFa和MFb則與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外,LMWF會(huì)對(duì)PAF誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ca2+內(nèi)流起到顯著的抑制作用,而MMWF則沒(méi)有這種抑制作用。
　　研究結(jié)果表明,LMWF

9、可通過(guò)抑制血小板的粘附和聚集,發(fā)揮抗血栓作用;而MMWF對(duì)血小板功能影響很小,其抗血栓作用更依賴(lài)于其他途徑。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),LMWF抑制血小板活化的具體作用機(jī)制是通過(guò)降低TXB2和升高6-Keto-PGF1α水平,以及抑制胞外Ca2+內(nèi)流來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　4.對(duì)不同分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯的抗凝活性和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究以抗血栓活性實(shí)驗(yàn)中確定的巖藻聚糖硫酸酯劑量為基礎(chǔ),通過(guò)體內(nèi)研究,首先對(duì)不同分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯的抗凝血活性進(jìn)行了比較

10、。并通過(guò)出血實(shí)驗(yàn),考察了不同分子質(zhì)量的海帶巖藻聚糖硫酸酯作為抗栓候選藥的安全性。最后,通過(guò)對(duì)調(diào)節(jié)凝血過(guò)程的幾種關(guān)鍵物質(zhì)TFPI、AT-Ⅲ、PC和FIB進(jìn)行檢測(cè),對(duì)其抗凝血機(jī)理進(jìn)行了深入探討。
　　結(jié)果顯示,海帶巖藻聚糖硫酸酯的抗凝活性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性,并且抗凝活性隨著分子質(zhì)量的增加而增加。此外,出血實(shí)驗(yàn)顯示,隨著海帶巖藻聚糖硫酸酯的分子質(zhì)量增加,出血危險(xiǎn)性也增加。
　　研究結(jié)果表明,不同分子質(zhì)量的巖藻聚糖硫酸酯,發(fā)揮抗凝

11、作用的機(jī)制也不同。對(duì)于LMWF而言,主要通過(guò)提高TFPI活性發(fā)揮作用;而MMWF除可通過(guò)TFPI途徑發(fā)揮抗凝作用外,當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí),會(huì)通過(guò)影響纖維蛋白原濃度發(fā)揮抗凝血作用。
　　5.考察了不同分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯對(duì)纖溶系統(tǒng)的影響及其作用機(jī)制首先通過(guò)體內(nèi)研究,考察巖藻聚糖硫酸酯對(duì)全血凝塊溶解實(shí)驗(yàn)、優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間兩個(gè)纖溶指標(biāo),對(duì)不同分子質(zhì)量的海帶巖藻聚糖硫酸酯纖溶活性進(jìn)行了比較。并通過(guò)大鼠動(dòng)脈血栓模型和靜脈血栓模型,考察了調(diào)

12、節(jié)體內(nèi)纖溶系統(tǒng)的關(guān)鍵指標(biāo)尿激酶型纖溶酶原活化劑(u-PA)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)等,以確定具體的作用機(jī)理。
　　結(jié)果顯示,海帶巖藻聚糖硫酸酯的纖溶活性隨著分子質(zhì)量的增加而逐漸增強(qiáng)。同時(shí),纖溶活性的強(qiáng)弱也呈現(xiàn)出一定的劑量相關(guān)性。說(shuō)明對(duì)巖藻聚糖硫酸酯可通過(guò)激活纖溶酶原轉(zhuǎn)換為纖溶酶發(fā)揮溶栓作用。從結(jié)果中還可以看出,其對(duì)纖溶酶原的激活主要是通過(guò)增強(qiáng)t-PA活性和抑制PAI-1活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的

13、。對(duì)u-PA活性并無(wú)影響。
　　6.考察了不同分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯對(duì)血液流變學(xué)的影響
　　通過(guò)制作大鼠血瘀模型,考察了巖藻聚糖硫酸酯對(duì)全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞沉降率等血液流變學(xué)參數(shù)的影響。
　　結(jié)果顯示,LMWF對(duì)各項(xiàng)血液流變學(xué)指標(biāo)均沒(méi)有改變,而MMWF可明顯降低全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞沉降率及血沉方程K值等指標(biāo),提示通過(guò)改善血液流變學(xué)指標(biāo),可能是MMWF發(fā)揮抗血栓作用的一個(gè)重要途徑。

14、
　　通過(guò)本文的研究,我們證實(shí)了海帶中提取的不同分子質(zhì)量的巖藻聚糖硫酸酯同時(shí)具有抗凝血和溶栓的功能,還可通過(guò)抑制血小板活化而發(fā)揮良好的內(nèi)皮保護(hù)作用,這是目前臨床所使用的抗血栓藥所不具備的,因此具有良好的開(kāi)發(fā)前景。
　　另外我們也發(fā)現(xiàn),海帶巖藻聚糖硫酸酯發(fā)揮抗血栓作用的的途徑隨著分子質(zhì)量的不同會(huì)發(fā)生改變,對(duì)于低分子質(zhì)量的海帶巖藻聚糖硫酸酯主要是通過(guò)抗凝血、抗血小板活化和纖溶功能發(fā)揮抗血栓作用;而對(duì)于中分子質(zhì)量海帶巖藻聚糖硫酸酯

15、來(lái)說(shuō),主要通過(guò)抗凝血、纖溶作用和改善血液流變學(xué)來(lái)發(fā)揮抗血栓作用。
　　通過(guò)本文的研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于同一種生物功能,其作用強(qiáng)弱甚至是作用機(jī)制也會(huì)隨著分子質(zhì)量的改變而發(fā)生改變。如LMWF與MMWF均具有抗凝血和纖溶作用,但這兩種作用都隨著海帶巖藻聚糖硫酸酯分子質(zhì)量的增加而增強(qiáng)。同時(shí),雖然不同分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯都具有抗凝血功能,但LMWF主要通過(guò)提高TFPI活性發(fā)揮作用;而MMWF除可通過(guò)TFPI途徑發(fā)揮抗凝作用外,當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí),會(huì)