Rock2基因在S期檢查點中的信號通路作用及對肝癌細胞影響的研究.pdf

1、目的：探討沉默Rock2基因?qū)θ烁伟┘毎鲋澈偷蛲鲎饔玫挠绊?；分析Rock2對下游蛋白Cdc25A的調(diào)節(jié)作用及機制；闡明Rock2的上游作用激酶。最終明確Rock2基因在S期檢查點中的信號通路作用及對肝癌細胞生物學活性的影響。
　　 方法：一、沉默人肝癌細胞Huh-7和HepG2中Rock2的表達，通過實時熒光定量PCR檢測Rock2 mRNA的表達水平；Western blot檢測Rock2蛋白的表達的水平；MTT比色法檢測沉

2、默Rock2后對Huh-7和HepG2細胞增殖抑制的影響；流式細胞術檢測沉默Rock2對Huh-7和HepG2細胞周期及早期凋亡的變化。二、Western blot檢測51對肝癌及癌旁組織中Rock2與Cdc25A的蛋白表達情況。構建并篩選shRock2干擾質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到人肝細胞癌Huh-7和HepG2細胞中，Western blot檢測Cdc25A蛋白表達變化；并針對Rock2干擾序列利用PCR定點突變技術進行堿基突變，構建Rock

3、2突變質(zhì)粒從而“恢復”Rock2表達，分析Cdc25A蛋白表達變化并用MTT法檢測肝癌細胞增殖的改變。Western blot檢測Rock2穩(wěn)定低表達的肝癌細胞中Chk1/Chk2蛋白的變化，免疫共沉淀及免疫熒光共定位技術分析Rock2與Cdc25A的相互作用關系。并探索Rock2通過調(diào)節(jié)Cdc25A泛素化進而對其降解的機制。三、通過生物信息學技術分析Rock2結構并參考相關預測軟件設計DNA損傷時被磷酸化位點的磷酸化多肽，制備相應特異

4、性磷酸化抗體。Western blot檢測電離輻射(IR)誘導DNA損傷時Rock2磷酸化位點。利用RNA干擾技術降低ATR/ATM的表達并造成DNA損傷時，Western blot檢測Rock2磷酸化位點的變化情況。將Rock2突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Rock2穩(wěn)定低表達的肝癌細胞中并IR照射，觀察Rock2突變體對肝癌細胞增殖的影響。
　　 結果：一、實時熒光定量PCR以及Western blot結果顯示，沉默肝癌細胞系Huh-7和

5、HepG2中Rock2表達后，Rock2 mRNA以及Rock2蛋白的表達水平均明顯下降；MTT結果顯示，沉默Rock2表達后Huh-7和HepG2細胞與對照組細胞相比，增殖能力明顯減弱(P<0.05)；流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)，沉默Rock2表達后的Huh-7和HepG2細胞G0/G1期細胞比例明顯升高，而S期和G2/M期細胞比例明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；沉默Rock2表達的Huh-7和HepG2細胞，肝癌

6、細胞的早期凋亡較對照組明顯增加(P<0.05)。二、Rock2與Cdc25A蛋白在肝癌組織中較癌旁組織呈現(xiàn)高表達，而且呈現(xiàn)正相關性。肝癌細胞中穩(wěn)定低表達Rock2后，Cdc25A蛋白表達明顯下降；“恢復”Rock2表達后，Cdc25A蛋白表達增加而且肝癌細胞也出現(xiàn)增殖加快現(xiàn)象。Rock2低表達對Chk1/Chk2蛋白變化無明顯影響。免疫共沉淀表明Rock2與Cdc25A直接相互作用，免疫熒光檢測表明Rock2與Cdc25A存在共定位。R