microRNA在SAMP8小鼠海馬區(qū)快速老化及神經(jīng)退行性疾病中的功能探究.pdf

1、阿爾茨海默癥(Alzheimer'sdisease,AD)是最為常見的引起老年癡呆的腦部神經(jīng)退行性疾病,臨床癥狀表現(xiàn)主要為記憶喪失,認(rèn)知障礙,行為異常等,其中海馬區(qū)是AD病程中腦內(nèi)最先受損的區(qū)域。隨年齡增加引起的衰老/老化是引起阿爾茨海默癥的最為重要的風(fēng)險(xiǎn)因素。AD患者腦中的主要病理學(xué)改變是存在廣泛的老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)。APP的異常剪接產(chǎn)生了Aβ蛋白,而Aβ的沉積作用引起老年斑的形成,Aβ的毒性作用被認(rèn)為與AD的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)。Ta

2、u蛋白高度磷酸化造成神經(jīng)纖維退化及功能喪失,形成雙股螺旋神經(jīng)絲和神經(jīng)纖維纏結(jié)。
　　 MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的大小在20～25nt的一類非編碼RNAs,主要通過與靶基因的3’UTR結(jié)合完全互補(bǔ)或不完全匹配,降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯,發(fā)揮調(diào)控作用。人類有接近1/3的基因受到miRNA的調(diào)控。根據(jù)目前的大量研究表明,miRNA參與生命活動(dòng)的各項(xiàng)重要過程。miRNA與細(xì)胞的衰老、凋亡、細(xì)胞命運(yùn)決定及老化

3、過程都存在著密切的關(guān)系；miRNA的異常表達(dá)可能引起疾病乃至腫瘤的發(fā)生。目前,發(fā)現(xiàn)很多miRNA與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。
　　 本研究選用了自然篩選的存在學(xué)習(xí)記憶障礙的早老癡呆模型小鼠——SAMP8小鼠為研究模型,開展工作。其對(duì)照小鼠為正常衰老的SAMR1小鼠。SAMP8小鼠主要表現(xiàn)為增齡過程中,中樞學(xué)習(xí)記憶功能快速衰退,且中樞神經(jīng)系統(tǒng)如皮質(zhì)、海馬等部位存在與AD類似的病理變化,如APP含量升高及淀粉樣蛋白Aβ沉積,是目前國際上普

4、遍認(rèn)可并采用的老化癡呆相關(guān)動(dòng)物模型。
　　 本研究首先檢測(cè)了SAMP8和SAMR1小鼠海馬組織中,APPmRNA水平和蛋白水平隨月齡的變化,發(fā)現(xiàn)正常小鼠與癡呆模型小鼠相比,APP蛋白水平在4,8,12-月齡的SAMP8小鼠中表達(dá)顯著增高,與其mRNA的水平變化趨勢(shì)不一致,提示可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。通過對(duì)APP3’UTR生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、Real-timePCR驗(yàn)證以及雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-16能夠結(jié)合于APP3’UTR,

5、并顯著下調(diào)熒光素酶的活性,轉(zhuǎn)染miR-16的抑制物能夠使熒光素酶活性顯著增高,并驗(yàn)證了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的miR-16與APP3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)為真性結(jié)合位點(diǎn)。
　　 在N2a細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中,過表達(dá)miR-16后,利用westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APP蛋白表達(dá)水平下調(diào)；利用腦立體定位注射技術(shù),將miR-16的模擬物注射入腦室,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)過表達(dá)miR-16能夠下調(diào)APP蛋白表達(dá)水平。
　　 通過原位雜交、免疫組織化

6、學(xué)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在SAM小鼠中,miR-16與APP蛋白的空間表達(dá)存在互補(bǔ)。在正常的神經(jīng)發(fā)育過程中,miR-16和APP的表達(dá)量和表達(dá)部位也分別體現(xiàn)出了很好的協(xié)調(diào)與互補(bǔ)性。證明miR-16可能通過調(diào)控AD發(fā)病過程中的關(guān)鍵蛋白APP與AD的病理機(jī)制相關(guān)。
　　 為了進(jìn)一步闡釋miRNA與老化和AD進(jìn)程的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)更多在老化與AD過程中,可能引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙的相關(guān)miRNA。我們利用miRNA芯片高通量篩選了在4,8,12-月齡中S

7、AMP8小鼠相比同月齡SAMR1小鼠海馬組織中具有顯著表達(dá)差異的miRNA,并得到了相應(yīng)差異表達(dá)miRNA的數(shù)據(jù)。經(jīng)過Real-timePCR、原位雜交等的驗(yàn)證和過濾,通過對(duì)部分差異表達(dá)miRNA的初步功能篩選和驗(yàn)證,我們選擇三個(gè)月齡之間均有表達(dá)差異的miR-9*,和與之來自于同一前體的miR-9作為首選研究對(duì)象,對(duì)其靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)miR-9能夠靶向MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白MAP3K3的3’UTR,miR-9*能夠靶向細(xì)