ADP-核糖基化因子1（ARF1）對大腸癌細(xì)胞株體外粘附性影響的研究.pdf

1、分類號星2塹：3UDC密級編號第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文ADP核糖基化因子1(ARFl)對大腸癌細(xì)胞株體外粘附。眭影響的研究RoleofADP—ribosylationFactorlfARFl)inCellAdhesionofColorectalCellLinesinVitro馬文敏指導(dǎo)教師姓名姜泊教授單位名稱及地址專業(yè)名稱論文提交日期論文答辯日期學(xué)位授予單位和日期第。軍醫(yī)大學(xué)2005年月n答辯委員會主席論文評闊人2005年5月15日摘要

2、上，LST—R1和LoVo更加明顯，表現(xiàn)為差異的倍數(shù)更高，且樣品對散點圖直觀地呈現(xiàn)出LSTR1和LoVo的差異更大。差異基因分類上，基因的功能集中在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝、發(fā)育、分化四個方面。根據(jù)文獻(xiàn)選取目的基因ADP核糖基化因子1(ADP—ribosylationfactor1，ARFl)進(jìn)一步研究，ARFI在LSTRI和另外兩者在差異幅度上居中。但其蛋白的功能卻覆蓋了基因芯片所篩選出的差異表達(dá)基因數(shù)目最多的四類中的三類即：信號傳導(dǎo)、分化、發(fā)

3、育。而且與細(xì)胞粘附密切相關(guān)。通過RT—PCR驗證表達(dá)確實存在差異，而蛋白免疫印跡則顯示LST和LoVo的差異顯著，和SW480的差別不顯著。免疫細(xì)胞組化可見此蛋白在三株細(xì)胞都表現(xiàn)為一致的胞漿表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了PdqAi的表達(dá)載體。分別轉(zhuǎn)染此表達(dá)載體和針對目的基因的小片段干擾RNA(smaUinterferenceRNA，siRNA)到細(xì)胞內(nèi)，并用蛋白免疫印跡證實轉(zhuǎn)染成功，且干擾是有效的。另一方面構(gòu)建了ARFl的表達(dá)載體，此載體同時共

4、表達(dá)綠色熒光蛋白，故可進(jìn)一步觀察目的蛋白在胞內(nèi)的分布，與免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果一致，即主要存在于胞漿內(nèi)，而且呈核周聚集。改變了LSTR1中ARFl的表達(dá)量后觀察細(xì)胞粘附力的變化，無論是直接合成的siRNA還是構(gòu)建的ARFl干擾載體，RNAi的結(jié)果是同質(zhì)黏附能力減弱了，而細(xì)胞一基質(zhì)粘附能力增加了。而轉(zhuǎn)染ARFl表達(dá)載體的LSTRI貝I]出現(xiàn)了兩種黏附能力的增強。結(jié)論：LST—RI相對另外兩個結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、LoVo在基因表達(dá)譜上確實存

5、在特殊性，通過基因芯片的篩選共發(fā)現(xiàn)相對于它們差異表達(dá)的基因共計97個，其中上調(diào)表達(dá)的58個，下調(diào)表達(dá)的39個。ARFl在LST—R1表達(dá)水平較高。ARFl介導(dǎo)粘著斑中柱蛋白的聚集，增強RhoA(GTP酶)誘導(dǎo)的肌動蛋白張力纖維的形成。因為粘著斑是細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間連接的橋梁，而肌動蛋白張力纖維也與細(xì)胞的運動性密切相關(guān)。所以ARFl間接地也在影響著細(xì)胞的粘附性和運動性。而本研究RNAi降低LSTR1中ARFI的表達(dá)量后的粘附性的改變說明

6、ARFl對結(jié)腸癌細(xì)胞株體外的粘附能力上的影響是：ARFl表達(dá)越高，則同質(zhì)黏附能力越強，細(xì)胞一基質(zhì)粘附能力越弱。而轉(zhuǎn)染ARFl表達(dá)載體的LSTRl則出現(xiàn)了，兩種黏附能力的增強。此結(jié)果，細(xì)胞一基質(zhì)黏附能力增加，和干擾的結(jié)果相反。這可能與增加ARFl的表達(dá)的時間比較長，而干擾ARFl的表達(dá)則相對時間比較短暫有關(guān)。CLST的側(cè)向生長恰恰可能是其同質(zhì)黏附性強、細(xì)胞基質(zhì)黏附性弱，從而導(dǎo)致它不會過早向粘膜下層侵襲。因此ARFl的上調(diào)表達(dá)可能導(dǎo)致CLS