原子力顯微鏡對大腸癌細胞株形貌特征的研究.pdf

1、[研究背景]
　　 大腸癌(CRC)是發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤之一，在世界最常見惡性腫瘤中列第四位，死亡率已躍居惡性腫瘤第二位，在我國惡性腫瘤中列第三位。由于對大腸癌的早期診斷率相對較低，發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，術后易發(fā)生復發(fā)轉移，因此對于大腸癌的早期診斷成為了近年來研究的重點。
　　 目前，在腫瘤的形態(tài)學診斷方面仍然依靠病理科醫(yī)師個人經(jīng)驗和對腫瘤細胞的識別能力，缺乏客觀判定指標和數(shù)據(jù)。因此，探討一種新的、能夠觀察其形貌特

2、征、更客觀、更準確、更早地識別癌前病變和早期癌細胞學改變的方法和技術，具有重要的學術價值和臨床意義。
　　 原子力顯微鏡(AFM)是一種具有納米級或亞納米級的超高分辨率、能對細胞的超微結構和機械性能進行精確成像的分析儀器。它是由Binning等在1986年由掃描隧道顯微鏡的基礎之上研制而成的，并在當時獲得了諾貝爾物理學獎。其所具有其他顯微技術所不具備的成像優(yōu)勢：1.可以觀察到的標本范圍非常廣泛，標本可以是金屬、半金屬及絕緣體等，

3、都可以用原子力顯微鏡進行觀察；2.具有極高的分辨率，能清晰地觀測到原子分子的形貌結構及力學特征；3.成像環(huán)境要求低，既可在空氣中成像，也可在其他的環(huán)境中成像；4.成像時間短，可及時準確的得到標本的三維形貌圖；5.探針如得到修飾以后可用于判別特定的分子及其相互的作用力，因此近年來被廣泛應用于包括臨床醫(yī)學在內(nèi)的各個領域，特別是觀察腫瘤細胞的機械性能與超微結構方面，顯示出其良好的應用前景。但目前對于大腸癌細胞株的形貌學特征的觀察研究鮮見報道。

4、
　　 [研究目的]
　　 本研究通過普通光鏡和原子力顯微鏡對比觀察大腸癌細胞株HT-29（HT-29）和耐5-FU的大腸癌細胞株HCT-8/5-FU（HCT-8/5-FU）的形貌學改變；對比觀察經(jīng)過5-FU處理、不同階段的HT-29和HCT-8/5-FU兩組細胞株的動態(tài)形貌學特征；探討原子力顯微鏡在大腸癌細胞形貌學檢測方面的應用價值，對比分析普通光學顯微鏡下主觀判斷的腫瘤形態(tài)學改變與原子力顯微鏡所分析的客觀數(shù)值間的相關

5、性。為癌前病變及大腸癌的早期病理形態(tài)學診斷探索新途徑；為應用化療藥物后根據(jù)大腸癌細胞形貌學改變判定耐藥與否等提供一個新思路。
　　 [研究方法]
　　 本實驗分為三個部分：
　　 1.采用細胞印片法和細胞爬片法分別對正常大腸上皮細胞和大腸癌細胞株HT-29進行制片，然后利用倒置相差顯微鏡和原子力顯微鏡對比觀察正常大腸上皮細胞和大腸癌細胞株HT-29的細胞形貌學特征。
　　 2.通過細胞培養(yǎng)及耐藥株的建立(

6、HCT-8/5-FU)，采用細胞爬片法制片，利用倒置相差顯微鏡及原子力顯微鏡對HT-29和HCT-8/5-FU兩組細胞株的形貌特征進行對比觀察。
　　 3.采用5ug/ml5-FU分別處理大腸癌細胞株HT-29和HCT-8/5-FU2h和6h后，利用倒置相差顯微鏡及原子力顯微鏡對應用化療藥物處理后不同時段兩組細胞的形貌特征進行對比觀察。
　　 [研究結果]
　　 1.普通光鏡下觀察大腸正常上皮細胞與大腸癌細胞株H

7、T-29，只能看到形狀及大小不同，沒有客觀數(shù)值。原子力顯微鏡掃描分析結果：大腸癌細胞株HT-29細胞直徑25.684±6.265、平均粗糙度94.800±11.375、平均峰高度11.764±3.278、平均凹陷程度-24.863±8.386及表面積差值2.511±1.254;大腸正常上皮細胞：直徑11.482±2.314、平均粗糙度13.105±6.307、平均峰高度7.827±2.673、平均凹陷程度-18.837±7.265、表面

8、積差值1.894±0.675;兩組有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，可量化評估。
　　 2.普通光鏡下觀察大腸癌細胞株HT-29和耐藥株HCT-8/5-FU,只能看到形狀及大小不同，沒有客觀數(shù)值。原子力顯微鏡掃描分析結果：耐藥株HCT-8/5-FU細胞直徑30.175±5.247、平均粗糙度98.750±10.460、平均峰高度16.856±2.673、平均凹陷程度-30.524±7.265及表面積差值5.278±1.175;

9、大腸癌細胞株HT-29細胞直徑25.684±6.265、平均粗糙度94.800±11.375、平均峰高度11.764±3.278、平均凹陷程度-24.863±8.386及表面積差值2.511±1.254;兩組有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，可量化評估。
　　 3.普通光鏡下觀察經(jīng)5-FU處理2、6小時后大腸癌細胞株HT-29和耐藥株HCT-8/5-FU細胞數(shù)量減少、細胞大小輕度改變，沒有客觀數(shù)值。原子力顯微鏡掃描分析結果：大

10、腸癌細胞株HT-29在0h、2h、6h的動態(tài)觀察過程中，細胞直徑25.684±6.265、31.356±5.018、49.073±4.147，平均粗糙度94.800±11.375、98.175±10.269、115.234±9.656，平均峰高度11.764±3.278、15.678±2.768、26.359±2.051，平均凹陷程度-24.863±8.386、-29.476±6.712、-35.317±6.018，表面積差值2.511

11、±1.254、2.959±0.976、6.768±0.873五個客觀數(shù)值均有明顯改變(P＜0.05)；而耐藥株HCT-8/5-FU細胞經(jīng)5-FU處理0h，2h、6h后，細胞直徑30.175±5.247,31.979±4.317、35.073±4.205，平均粗糙度98.750±10.460，99.265±9.475、101.670±9.015，平均峰高度16.856±2.673，17.569±2.113、19.478±1.964，平均凹

12、陷程度-30.524±7.265，-31.263±6.055、-32.456±5.798，表面積差值5.278±1.175,5.924±1.013、6.567±0.927五個客觀數(shù)值比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。此外，兩種細胞株在5-FU處理0h和6h的細胞直徑、平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷程度及表面積差值五個客觀數(shù)值比較有顯著差異(P＜0.05);5-FU處理2h的五個客觀數(shù)值兩組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　

13、 [研究結論]
　　 1.原子力顯微鏡掃描觀察正常大腸上皮細胞和大腸癌細胞株HT-29的細胞形貌學特征，可以得出客觀數(shù)值（普通光學顯微鏡所觀察不到的、精細的形貌特征數(shù)據(jù)），有助于量化判定細胞的良惡性。提示原子力顯微鏡形貌學觀察可以用于大腸癌細胞的客觀判定。
　　 2.原子力顯微鏡形貌學特征量化分析非耐藥株HT-29與耐藥株HCT-8/5-FU精細的形貌學特征，有助于從形貌學改變判別耐藥與否。
　　 3.原子力顯