組蛋白H3精氨酸單ADP核糖基化對大腸癌細胞E-cadherin表達影響的初步研究.pdf

1、研究目的:初步探討大腸癌組蛋白H3精氨酸單ADP核糖基化修飾對大腸癌細胞E-cadherin表達的影響及其可能的機制。
　　方法:本課題分為四部分。
　　1.單腺苷二磷酸核糖基化轉移酶ARTD8和ARTD14在人大腸腺癌組織中的表達及意義:采用免疫組織化學方法對65例大腸癌組織標本分別檢測ARTD8和ARTD14在大腸癌組織的表達情況。
　　2.不同分化程度大腸癌細胞株組蛋白單ADP核糖基化修飾差異檢測:應用四級串聯質

2、譜檢測人大腸癌LOVO細胞株和SW480細胞株中組蛋白單ADP核糖基化修飾的差異。
　　3.組蛋白H3第117位精氨酸單ADP核糖基化對大腸癌細胞E-cadherin表達及癌細胞遷移能力的影響：（1）分別將 pLenti-H3 mut1-IRES-eGFP和pLenti-H3 mut2-IRES-eGFP慢病毒載體穩(wěn)定轉染至人大腸癌LOVO細胞，構建穩(wěn)定氨基酸突變細胞株。（2）Western Blot和 QPCR分別檢測未轉染 L

3、OVO細胞組、轉染空載體 LOVO細胞組（LV-control LOVO細胞組）、H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組中E-cadherin蛋白和mRNA水平。（3）細胞劃痕實驗、Transwell遷移能力實驗檢測未轉染LOVO細胞組、轉染空載體LOVO細胞組、H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組癌細胞遷移能力。
　　4.組蛋白H3第117位精氨酸單 ADP核糖基化對大腸

4、癌細胞E-cadherin影響的分子機制研究:（1）Western Blot檢測未轉染LOVO細胞組、轉染空載體LOVO細胞組、H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組中PARP1蛋白水平。（2）Western Blot檢測未轉染LOVO細胞組、轉染空載體LOVO細胞組、H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組中H3K9甲基化水平。（3）QPCR檢測未轉染LOVO細胞組、轉染空載體LO

5、VO細胞組、H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組中FBP1的mRNA的轉錄水平。
　　結果：
　　1.單腺苷二磷酸核糖基化轉移酶ARTD8和ARTD14在人大腸腺癌組織中的表達及意義。
　　(1)ARTD8在大腸腺癌和正常大腸組織中均有表達，在大腸腺癌細胞，ARTD8主要分布于細胞質中，同時見于部分細胞核中；在正常大腸黏膜腺體，則僅分布于細胞質中。ARTD8在大腸腺癌組織中表達強度高于正常

6、大腸黏膜細胞（P<0.05）。直腸腺癌細胞ARTD8核陽性表達率高于正常大腸黏膜（ P<0.05），同時高于結腸腺癌細胞核陽性表達率（P<0.05）。
　　(2)ARTD14在大腸腺癌和正常大腸組織中均有表達，在大腸腺癌細胞，ARTD14主要分布于細胞質中，同時見于部分細胞核中；在正常大腸黏膜腺體，則僅分布于細胞質中。ARTD14在大腸腺癌組織中表達強度高于正常大腸黏膜細胞（P<0.05），并與腫瘤的分化程度存在相關性（P<0.0

7、5）。結腸腺癌細胞 ARTD14核陽性表達率高于正常大腸黏膜（P<0.05）。
　　2.不同分化程度人大腸癌細胞株中組蛋白單 ADP核糖基化修飾的檢測:四級串聯質譜檢測結果顯示，LOVO細胞組蛋白H3的第117位精氨酸存在單ADP核糖基化修飾，而SW480細胞組蛋白H3第117位則不存在這一修飾。
　　3.組蛋白H3第117位精氨酸單ADP核糖基化對大腸癌細胞E-cadherin表達及癌細胞遷移能力的影響。
　　(1)

8、將pLenti-H3 mut1-IRES-eGFP和pLenti-H3 mut2-IRES-eGFP慢病毒載體分別轉染至人大腸癌LOVO細胞，熒光顯微鏡下觀察，轉染空載體LOVO細胞、H3 R117A LOVO細胞和H3 R117K LOVO細胞均可以見到綠色熒光，而且熒光細胞達到總細胞數的80％。
　　(2)Western Blot、QPCR結果顯示H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組E-cadhe

9、rin蛋白和mRNA水平較未轉染LOVO細胞組、轉染空載體 LOVO細胞組 E-cadherin蛋白和 mRNA水平明顯增加。未轉染LOVO細胞組與轉染空載體LOVO細胞組無明顯差異，H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組無差異。
　　(3)細胞劃痕實驗、Transwell遷移實驗結果顯示，H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組中細胞的遷移能力比未轉染LOVO細胞組、轉染空載

10、體LOVO細胞組低。未轉染LOVO細胞組與轉染空載體LOVO細胞組無明顯差異，H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組無差異。
　　4.組蛋白H3第117位精氨酸單ADP核糖基化對大腸癌細胞E-cadherin影響的分子機制研究
　　(1)Western Blot結果顯示H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組中PARP1蛋白水平較未轉染LOVO細胞組、轉染空載體LOVO細

11、胞組明顯降低。未轉染LOVO細胞組與轉染空載體LOVO細胞組無明顯差異，H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組無差異。
　　(2)Western Blot結果顯示H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組中H3K9me2水平較未轉染LOVO細胞組、轉染空載體LOVO細胞組明顯下降。未轉染LOVO細胞組與轉染空載體LOVO細胞組無明顯差異，H3 R117A LOVO細胞組和H3 R

12、117K LOVO細胞組無差異。
　　(3)QPCR結果顯示H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組中FBP1 mRNA水平較未轉染LOVO細胞組、轉染空載體LOVO細胞組明顯增加。未轉染LOVO細胞組與轉染空載體LOVO細胞組無明顯差異， H3 R117A LOVO細胞組和H3 R117K LOVO細胞組無差異。
　　結論：
　　1.ARTD8和ARTD14在大腸癌組織表達強度較正常大腸組織

13、高，ARTD14表達與大腸癌分化程度存在相關性，提示ARTD8和ARTD14可能與大腸癌發(fā)生發(fā)展有關；直腸腺癌細胞ARTD8核陽性表達率高于正常大腸黏膜、結腸腺癌細胞ARTD14核陽性表達率高于正常大腸黏膜，提示大腸癌核內也存在著單ADP核糖基化作用，ARTD8和ARTD14可能影響組蛋白單ADP核糖基化修飾對大腸癌發(fā)揮調節(jié)作用，但具體作用氨基酸位點尚有待進一步研究。
　　2.組蛋白H3第117位精氨酸單ADP核糖基化作用可以影響