中藥復(fù)方配伍的化學變化與復(fù)方中藥的質(zhì)量表征.pdf

1、本課題通過研究配伍前后龍膽瀉肝湯、桂枝湯中指標成分在體內(nèi)外的動態(tài)變化特點，從某些方面揭示了中藥復(fù)方配伍理論的科學內(nèi)涵；通過分別建立龍膽瀉肝丸與桂枝顆粒多組分同時分析方法，闡明了復(fù)方中藥多指標質(zhì)量表征的必要性和可行性。研究結(jié)果表明：(1)關(guān)木通在龍膽瀉肝湯中配伍以后可以降低有毒成分馬兜鈴酸A的煎出量(n=6，P<0.05)，當歸與關(guān)木通的配伍抑制了馬兜鈴酸A的煎出量；(2)在桂枝湯中，桂枝、白芍配伍前后桂皮酸、芍藥苷的煎出量未見明顯改變

2、(n=6，P>0.05)；但復(fù)方配伍后總多糖煎出量增加；炙甘草配伍以后甘草酸的煎出量也明顯降低(n=6，P<0.01)，煎液 pH 值的改變可能是含量降低的原因；(3)桂枝湯在大鼠體內(nèi)的藥代動力學表明，桂枝煎液與桂枝湯中桂皮酸在大鼠體內(nèi)的代謝過程基本一致，而炙甘草煎液與桂枝湯中甘草酸在大鼠體內(nèi)的代謝過程有所差異，表現(xiàn)為桂枝湯中甘草酸的藥代參數(shù) C<,max>、AUC均顯著增大 (n=6，P<0.01)，T<,1/2>Ke、T<,max>

3、均顯著降低 (n=6，P<0.01)。(4)建立了能夠同時測定龍膽瀉肝丸3個組分的RP-HPLC分析方法，該法具有專屬性強、靈敏度高、快速、準確等優(yōu)點，可以用于該制劑的質(zhì)量評價與質(zhì)量控制。(5)建立了能夠同時測定桂枝顆粒3個組分的RP-HPLC分析方法，該方法可以較全面地表征桂枝顆粒的質(zhì)量。 一、中藥復(fù)方配伍的化學變化研究. (一)配伍對龍膽瀉肝湯中馬兜鈴酸A煎出量的影響 ①關(guān)木通配伍前后馬兜鈴酸A煎出量的變化

4、 目的：比較關(guān)木通配伍前后馬兜鈴酸A含量的差異，研究傳統(tǒng)龍膽瀉肝湯配伍的科學依據(jù)。 方法：采用HPLC測定關(guān)木通單煎液與龍腥瀉肝湯中馬兜鈴酸A的含量。 結(jié)果：馬兜鈴酸A在0.76～51.0 μg·mL<'-1>范圍內(nèi)線性良好，關(guān)木通單煎液和復(fù)方煎液的方法回收率分別為 98.6％和96.5％；單煎液中馬兜鈴酸A的含量明顯高于復(fù)方煎液(n=6，P<0.05)。 結(jié)論：關(guān)木通在龍膽瀉肝湯中配伍以后可以降低馬兜鈴酸

5、A的煎出量。 ②拆方研究配伍前后馬兜鈴酸A煎出量的變化. 目的：研究復(fù)方配伍以后龍膽瀉肝湯中馬兜鈴酸A煎出量變化的原因。 方法：以中醫(yī)藥理論為指導，采用撤藥分析法對龍膽瀉肝湯進行拆方，建立HPLC測定了各拆方組中馬兜鈴酸A的煎出量，同時對數(shù)據(jù)進行了ANOVA分析。 結(jié)果：當歸和(或)生地與關(guān)木通配伍可以影響馬兜鈴酸A的煎出量。 結(jié)論：按照中醫(yī)理論，復(fù)方配伍能夠降低關(guān)木通中馬兜鈴酸A的煎出量，可以降

6、低腎毒性。 ③關(guān)木通與當歸、生地配伍后的馬兜鈴酸A含量的變化. 目的：探究關(guān)木通與當歸、生地配伍后的馬兜鈴酸A含量變化的原因。 方法：采用HPLC法測定各拆方組中馬兜鈴酸A的煎出量，同時測定各組藥渣中馬兜鈴酸A的含量，以計算回收率。 結(jié)果：各煎液藥渣中馬兜鈴酸 A 的回收率均不低于96.7％，關(guān)木通與當歸配伍可以使馬兜鈴酸A的煎出量降低41.3％ (n=5，P<0.01)。 結(jié)論：關(guān)木通與當歸配伍

7、共煎，煎煮過程馬兜鈴酸A未發(fā)生化學反應(yīng)生成新物質(zhì)或分解，當歸的加入可抑制馬兜鈴酸A的煎出量。 (二) 配伍對桂枝湯中桂皮酸、芍藥苷、甘草酸及總多糖煎出量的影響 ①配伍對桂枝湯中的桂皮酸、芍藥苷和甘草酸煎出量的影響. 目的：比較配伍前后桂枝湯中桂皮酸、芍藥苷和甘草酸煎出量的變化。 方法：建立HPLC測定各單味藥煎液與桂枝湯中指標成分的含量。 結(jié)果：桂皮酸、芍藥苷、甘草酸的濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)

8、系，各指標成分的平均回收率均在98.0％～101.0％之間；桂枝在桂枝湯中配伍前后桂皮酸含量未見明顯改變(n=6，P>0.05)，白芍在桂枝湯中配伍以后芍藥昔含量未見明顯改變(n=6，P>0.05)，而炙甘草配伍后甘草酸含量降低了近50％(n=6，P<0.01)。 結(jié)論：中藥復(fù)方配伍由于體系微環(huán)境的改變或發(fā)生物理化學變化，某些指標成分煎出量有可能發(fā)生改變。 ②拆方研究配伍對桂枝湯中甘草酸含量的影響. 目的：研究復(fù)

9、方配伍以后桂枝湯中甘草酸煎出量變化的原因。 方法：采用正交設(shè)計法對桂枝湯進行拆方，建立HPLC測定了各組甘草酸的煎出量，同時測定各煎液pH。 結(jié)果：甘草酸在8.75～280 μg·mL<'-1>內(nèi)線性關(guān)系良好，甘草酸的平均回收率為99.4％；因素 B (白芍用藥/不用藥) 對桂枝湯中甘草酸的煎出量的影響有統(tǒng)計學意義(n=8，P<0.01)，各煎液pH有所差異。 結(jié)論：白芍的加入降低了甘草酸的煎出量，煎液pH的降低

10、可能是煎出量改變的直接原因。 ③桂枝湯分煎液與合煎液中總多糖含量的比較研究. 目的：比較桂枝湯分煎液和合煎液中總多糖含量的差異，探討復(fù)方配伍的合理性。 方法：采用苯酚-硫酸法來測定多糖含量，對兩組煎液的總多糖含量進行方差分析。 結(jié)果：葡萄糖在 20～120μg·mL<'-1>范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均換算因子為 1.884，桂枝湯單煎合液與共煎液中多糖平均含量分別為 16.3 mg·mL<'-1>、22.1

11、 mg·mL<'-1>。 結(jié)論：桂枝湯復(fù)方共煎可以增加總多糖的溶出量。 (三)配伍對桂枝湯中桂皮酸與甘草酸的藥代動力學影響. 目的：比較大鼠灌冒桂枝煎液、甘草煎液、桂枝湯煎液后桂皮酸與甘草酸的藥代動力學參數(shù)的差異。 方法：大鼠在灌胃桂枝煎液、甘草煎液及桂枝湯后，利用 HPLC 法測定血漿中桂皮酸與甘草酸的濃度，利用3P87藥代動力學軟件估算相應(yīng)的藥代動力學參數(shù)。 結(jié)果：桂皮酸與甘草酸在大鼠體內(nèi)的藥代

12、學過程均符合二室模型。桂枝煎液與桂枝湯中桂皮酸在大鼠體內(nèi)的代謝過程基本一致，而炙甘草煎液與桂枝湯中甘草酸在大鼠體內(nèi)的代謝過程有所差異，表現(xiàn)為桂枝湯中甘草酸的藥代參數(shù) C<,max>、AUC均顯著增大 (n=5，P<0.01)，T<,1/2>Ke、T<,max>均顯著降低(n=5，P<0.01)。 結(jié)論：桂枝湯復(fù)方配伍甘草酸的吸收程度增大，復(fù)方配伍具有合理性。 二、復(fù)方中藥的質(zhì)量表征 (一) HPLC 測定龍膽瀉肝

13、丸中龍膽苦苷、黃芩苷、梔子苷 目的：建立HPLC同時測定龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷、黃芩苷、梔子苷三個指標成分的含量。 方法：采用Hypersil C<,18>色譜柱 (250×4.6 mm，5.0μm)；流動相由乙腈-1％冰醋酸溶液組成；檢測波長254 nm；流速1.0 mL·min<'-1>。 結(jié)果：梔子苷、龍膽苦苷、黃芩苷的線性范圍分別為4.60～147μg·mL<'-1>、9.05～290μg·mL<'-1>和

14、8.40～268μg·mL<'-1>(r均大于0.999 9、)，平均回收率均大于98.1％。 結(jié)論：該方法專屬性強，結(jié)果準確可靠，重現(xiàn)性好，可以同時測定龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷、黃芩苷、梔子苷三個指標成分的含量，可以較全面地表征該丸的質(zhì)量。 (二)HPLC測定桂枝顆粒中桂皮酸、芍藥苷、甘草酸. 目的：建立HPLC同時測定桂枝顆粒中桂皮酸、芍藥苷、甘草酸三個指標成分的含量。 方法：采用Phenomenex C

15、<,18>色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相由乙腈-1％冰醋酸溶液(調(diào)pH為3.7)進行梯度洗脫，流速1.0 mL·min<'-1>；檢測波長250 nm；柱溫為室溫；進樣量20μL。 結(jié)果：芍藥苷、桂皮酸、甘草酸分別在 1.898～121.5μg·mL<'-1>、1.969～126μg·mL<'-1>、2.5～160μg·mL<'-1>內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 8；芍藥苷、桂皮酸、甘草酸的平均