轉(zhuǎn)Nurr1基因聯(lián)合全反式維甲酸及銀杏提取物誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞治療帕金森病大鼠模型.pdf

1、研究背景：帕金森病(Parkinson's disease,PD)中老年人群中一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其基本病理改變是黑質(zhì).紋狀體多巴胺系統(tǒng)進(jìn)行性變性，臨床以震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩及姿勢(shì)平衡障礙為主要特征。目前該病的臨床治療主要依靠藥物和外科手術(shù)，兩者均屬對(duì)癥性，因而均不能阻止病情的進(jìn)行性發(fā)展，很多中晚期病人的癥狀常不能得到有效控制，致殘率極高。細(xì)胞移植治療是比較有前景的治療手段。神經(jīng)干細(xì)胞是具有多向分化潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞，在不同

2、的誘導(dǎo)條件下可分化為不同類型的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，被認(rèn)為在帕金森病的細(xì)胞及基因治療方面具有一定的應(yīng)用潛力。孤兒核受體(nuclear related regulator-1，Nurr1)是類固醇/甲狀腺激素核受體超家族成員的轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育并維持其表型。我們前期工作結(jié)果表明Nurr1基因修飾和全反式維甲酸及銀杏提取物誘導(dǎo)可以促進(jìn)NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化，但這種體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)PD是否有治療效應(yīng)還沒有得到證實(shí)

3、。 目的：探討Nurr1基因修飾聯(lián)合全反式維甲酸(ATRA)及銀杏提取物(Egb)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植治療帕金森病動(dòng)物模型的療效及作用機(jī)制。 方法：體外分離、純化和擴(kuò)增培養(yǎng)大鼠胚胎皮質(zhì)來源的NSCs，電穿孔法轉(zhuǎn)導(dǎo)Nurr1表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-hygro-Nurr1)至NSCs，經(jīng)潮霉素篩選攜帶Nurr1基因的NSCs，撤除表皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維生長因子(EGF/bFGF)，添加ATRA、Eg

4、b，誘導(dǎo)分化NSCs 7天后，收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，供移植。另外，將轉(zhuǎn)染Nurr1基因而未經(jīng)ATRA/Egb誘導(dǎo)分化的NSCs，ATRA/Egb誘導(dǎo)分化而未轉(zhuǎn)染Nurr1基因的NSCs，沒有做特殊處理自然分化的NSCs分別制備成細(xì)胞懸液，供移植作為對(duì)照組。將建模成功的46只帕金森病SD大鼠模型隨機(jī)分為四組，即 (1)Nurr1+RA/Egb組：接受Nurr1基因修飾結(jié)合.ATRA/Egb誘導(dǎo)分化的NSCs移植組； (2

5、)Nurr1組： 接受Nurr1基因修飾而未經(jīng)ATRA/Egb誘導(dǎo)分化的NSCs移植組； (3)RA/Egb組：接受ATRA/Egb誘導(dǎo)分化而未Nurr1基因修飾的NSCs組； (4)接受沒有特殊處理的讓其自然分化的NSCs組。將溴尿嘧啶(Brdu)標(biāo)記的單純胚胎NSCs(NSCs組)、RA/Egb誘導(dǎo)分化的NSCs(RA/Egb組)、單純轉(zhuǎn)Nurr1基因的NSCs(Nurr1組)和轉(zhuǎn)Nurr1基因聯(lián)合RA/Eg

6、b誘導(dǎo)分化的NSCs(Nurr1+RA/Egb組)分別移植至模型鼠右側(cè)紋狀體。在移植后不同時(shí)點(diǎn)觀察其旋轉(zhuǎn)行為的改善。采用免疫組化染色方法檢測(cè)酪氨酸羥化酶(TH)、核受體相關(guān)因子(Nurr1)、神經(jīng)絲巢蛋白(nestin)表達(dá)及Brdu標(biāo)記情況，觀察移植的NSCs在體內(nèi)的存活、遷移，并進(jìn)行TH陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察移植后腦內(nèi)移植部位TH陽性細(xì)胞數(shù)的變化。 結(jié)果：各組動(dòng)物腦內(nèi)移植后動(dòng)物旋轉(zhuǎn)行為較前均有改善，尤以Nurr1+RA/Egb組改

7、善最明顯。免疫組化可見各組移植區(qū)均有TH陽性細(xì)胞表達(dá)，其中Nurr1+RA/Egb組可發(fā)現(xiàn)更多的TH陽性細(xì)胞，可見TH陽性細(xì)胞有突起，形態(tài)更成熟。在Nurr1組和Nurr1+RA/Egb組移植區(qū)可見有Nurr1散在表達(dá)，但nestin檢測(cè)未見有陽性表達(dá)。 結(jié)論：轉(zhuǎn)Nurr1基因聯(lián)合全反式維甲酸及銀杏提取物誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)干細(xì)胞腦內(nèi)移植后可以改善PD模型旋轉(zhuǎn)行為。移植入PD大鼠模型腦內(nèi)的細(xì)胞可以存活、遷移，這些部分細(xì)胞可表達(dá)TH和