青蒿琥酯抗炎與抗菌增敏作用在其保護細菌膿毒癥模型小鼠中的作用及機制研究.pdf

1、目的： 膿毒癥(Sepsis)是由感染因素引起的全身失控性炎癥反應綜合癥(Systemicinflammatoryresponsesydrome，SIRS)，由其導致的膿毒癥休克和多器官功能障礙綜合癥(multipleorgandysfuctionsyndrome，MODS)是死亡的重要原因，病死率高達50％-80％，至今尚無有效的治療手段。 目前認為，菌體成分如細菌基因組DNA和存在于革蘭陰性細菌外膜的脂多糖/內毒素(

2、lipopolysaccharide/endotoxin，LPS)等是誘導膿毒癥發(fā)生的主要致病因子。雖然抗菌藥物可抑制細菌的增殖，達到治療感染性疾病的目的，但已有大量實驗表明，許多抗菌藥物尤其是β-內酰胺類抗生素在殺死細菌的同時，能促使內毒素從細菌胞膜的釋放而加重感染。因此，尋找具有治療細菌膿毒癥的藥物對提高感染性疾病的治療效果具有重要意義。 我們實驗室前期的工作已證實：青蒿素對LPS、CpGODN、熱滅活大腸埃希菌攻擊小鼠具有

3、顯著的保護作用；其與β-內酰胺類抗生素同時使用可對活大腸埃希菌攻擊小鼠具有顯著保護作用。但是，由于青蒿素不溶于水或油，僅能口服給藥，不適宜于重癥膿毒癥病人的搶救。 青蒿素的4種衍生物包括雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚及青蒿琥酯，均可靜脈、肌肉給藥，劑型適合重癥患者使用。鑒于與青蒿素相似的化學結構，推測它們可能具有治療膿毒癥的效果。 為此，本課題擬通過體外細胞因子實驗篩選出對不同致炎成分誘導的細胞因子釋放有較強抑制作用的青蒿素

4、衍生物；在上述工作基礎上，采用不同膿毒癥模型研究該青蒿素衍生物防治細菌膿毒癥的作用并探討其可能的作用機制，為尋找有效的治療細菌膿毒癥的藥物并拓寬青蒿素及其衍生物的臨床適應癥提供實驗依據。 方法： 一、雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚抑制炎性細胞因子釋放的活性篩選：ELISA法觀察三種衍生物對不同刺激物誘導的小鼠原代腹腔巨噬細胞和傳代巨噬細胞系RAW264.7細胞釋放TNF-α、IL-6的影響。 二、青蒿琥酯對細菌膿毒

5、癥模型小鼠的保護作用：分別建立熱滅活大腸埃希菌攻擊膿毒癥小鼠模型、活大腸埃希菌攻擊膿毒癥小鼠模型和CLP膿毒癥小鼠模型，觀察青蒿琥酯對不同膿毒癥模型小鼠的保護作用。 三、青蒿琥酯對細菌膿毒癥模型小鼠保護作用的分子機制研究。 (一)青蒿琥酯的抗炎作用分子機制研究。 1.生物傳感器技術研究青蒿琥酯與LPS/lipidA或CpGODN的直接結合作用； 2.鱟試劑動態(tài)濁度法檢測青蒿琥酯對內毒素的體外中和作用；

6、 3.流式細胞術觀察青蒿琥酯對CpGODN在RAW264.7細胞表面結合及細胞內聚集的影響： 4.RT-PCR觀察青蒿琥酯對TLR4mRNA、TLR9mRNA表達的影響；免疫熒光技術檢測青蒿琥酯對TLR9蛋白表達的影響； 5.ELISA法檢測青蒿琥酯對NF-κB活化的影響； (二)青蒿琥酯抗菌增敏作用及其機制研究。 1.采用微孔稀釋法觀察青蒿琥酯和不同抗菌藥物的MIC、青蒿琥酯和不同抗菌藥物聯合使用時

7、對大腸埃希菌國際標準株ATCC35218和臨床分離株MICs的影響； 2.采用動態(tài)生長曲線法觀察青蒿琥酯和不同抗菌藥物聯合使用時對大腸埃希菌ATCC35218和大腸埃希菌臨床分離株的體外協同抗菌作用； 3.采用激光共聚焦、熒光分光光度法觀察青蒿琥酯對柔紅霉素在大腸埃希菌ATCC35218內聚集的影響； 4.透射電鏡技術觀察青蒿琥酯對大腸埃希菌ATCC35218胞膜通透性的影響。 結果： 一、雙氫青

8、蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚抑制炎性細胞因子釋放的活性篩選三種青蒿素衍生物中，青蒿琥酯抑制炎性細胞因子釋放的作用最強。 二、青蒿琥酯對細菌膿毒癥模型小鼠的保護作用。 1.青蒿琥酯能明顯延遲熱滅活大腸埃希菌攻擊模型小鼠的死亡時間，降低膿毒癥小鼠的死亡率，其保護作用可能與其降低熱滅活大腸埃希菌攻擊小鼠血清內毒素和TNF-α的水平有關； 2.青蒿琥酯與慶大霉素、舒氨西林聯合使用對活大腸埃希菌攻擊膿毒癥模型小鼠具有協同保護作用

9、； 3.青蒿琥酯與舒氨西林聯合使用對CLP膿毒癥模型小鼠具有協同保護作用。 三、青蒿琥酯對膿毒癥模型小鼠保護作用的分子機制研究。 (一)青蒿琥酯的抗炎作用的機制研究。 1.青蒿琥酯在體外不能直接結合LPS和CpGODN，對LPS無中和作用； 2.青蒿琥酯對CpGODN表面的結合，但增加CpGODN在細胞內的聚集； 3.青蒿琥酯可抑制熱滅活大腸埃希菌、LPS和CpGODN誘導的RAW264.

10、7細胞TLR4mRNA和TLR9mRNA高表達和TLR9蛋白的表達； 4.青蒿琥酯可抑制熱滅活大腸埃希菌誘導的RAW264.7細胞NF-κB的活化。 (二)青蒿琥酯的抗菌增敏作用及機制研究。 1.青蒿琥酯單獨使用幾乎沒有抗菌作用，但與不同抗生素聯合使用時對大腸埃希菌可產生明顯的抗菌增敏作用； 2.青蒿琥酯可增加柔紅霉素在細菌內聚集，呈顯著的量效和時效關系； 3.一定濃度的青蒿琥酯預處理可破壞大腸埃

11、希菌細胞膜結構的完整性，其抗菌增敏作用機制可能與青蒿琥酯增加抗菌藥物在細菌內的聚集有關。 結論： 1.雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚3種青蒿素衍生物中，青蒿琥酯抑制炎性細胞因子釋放的作用最強； 2.青蒿琥酯對熱滅活大腸埃希菌攻擊膿毒癥模型小鼠具有顯著的保護作用，青蒿琥酯與抗菌藥物聯合使用對活大腸埃希菌攻擊膿毒癥和CLP膿毒癥模型小鼠均具有協同保護作用； 3.青蒿琥酯的抗炎作用機制可能與抑制TLR4、TLR9