聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在低剪切力誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、論文Ⅰ
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在低剪切力誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中的作用及機(jī)制研究
　　 研究背景及目的
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病，最先發(fā)生于血流動(dòng)力學(xué)紊亂的血管分叉或狹窄的部位。局部血流變化與這種部位特異性密切相關(guān)，其中一個(gè)重要的因素是剪切力(WSS)。剪切力是血液在血管中流動(dòng)時(shí)對血管內(nèi)膜產(chǎn)生的一種摩擦力。剪切力的大小與血液流速成正比，比管腔半徑成反比。生理剪切力的大小介于0.5

2、-1.2Pa，小于0.5Pa或者大于1.2Pa分別稱為低剪切力和高剪切力。剪切力作用于內(nèi)皮細(xì)胞能引起胞內(nèi)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激活，如蛋白激酶C(PKC)、絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等。此外，低剪切力能夠促進(jìn)促動(dòng)脈硬化物質(zhì)在管腔和管壁之間的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是一種高度保守的DNA結(jié)合蛋白。作為一種核酶，PARP-1參與了DNA損傷后的修復(fù)。一旦與損傷的DNA結(jié)合

3、，PARP-1會(huì)被激活并催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解為尼克酰胺和ADP核糖，從而在DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡、染色體功能和遺傳穩(wěn)定性中發(fā)揮重要的作用。然而，PARP-1過度活化會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP的耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞能量危機(jī)、細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡。研究證實(shí)氧化應(yīng)激引起的PARP-1過度活化與各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如內(nèi)皮功能障礙、休克、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等。此外，作為核因子κB(NF-κB)的激活物

4、，PARP-1能夠調(diào)節(jié)各種關(guān)鍵炎癥因子的表達(dá)，如單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等。
　　 在以往研究的基礎(chǔ)上，我們提出如下假設(shè):1）低剪切力能引起氧化應(yīng)激并導(dǎo)致DNA損傷，從而激活PARP-1;2）PARP-1在低剪切力引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。
　　 本研究正是基于以上思路，擬應(yīng)用低剪切力刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）以驗(yàn)證這一假說。旨在探

5、討PARP-1在低剪切力引起的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用和可能的機(jī)制，以期尋找到與低剪切力相關(guān)的炎癥性疾病的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。
　　 材料與方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及剪切力模型建立:
　　 本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為研究對象;低剪切力(0.4Pa)刺激以誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，靜態(tài)狀態(tài)下培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對照。
　　 2.細(xì)胞內(nèi)基因蛋白

6、表達(dá)的干預(yù):
　　 采用PARP-1抑制劑ABT888或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PARP-1小干擾RNA片段的方式實(shí)現(xiàn)對臍靜脈細(xì)胞內(nèi)PARP-1表達(dá)的干預(yù);采用SP600125，SB203580和U0126抑制劑來抑制JNK、P38和ERK的活性。
　　 3.實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Real-timeRT-PCR):
　　 收集各組細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR，檢測各組細(xì)胞中iNOS和ICAM-1mRNA的表達(dá)水平

7、。
　　 4.蛋白印跡(Westernblotting):
　　 收集各組細(xì)胞，提取蛋白，分別檢測ICAM-1、iNOS、PARP-1、PAR、nitrotyrosine、H2A-X、p-H2A-X、c-Jun、p-c-Jun、MAPKAPK-2、p-MAPKAPK-2、ERK、p-ERK、Sirt1、IκBα和p-p65等蛋白的表達(dá)水平。
　　 5.細(xì)胞免疫熒光:
　　 顯示細(xì)胞超氧陰離子的生成，細(xì)胞內(nèi)

8、的NF-κBP65亞基的表達(dá)及轉(zhuǎn)位情況。
　　 6.分光光度法:
　　 收集各組細(xì)胞，使用相應(yīng)試劑盒以檢測細(xì)胞內(nèi)NAD+的水平和Sirt1的活性。
　　 7.彗星實(shí)驗(yàn)(cometassay):
　　 收集各組細(xì)胞，檢測細(xì)胞DNA損傷程度。
　　 8.電泳遷移率檢測(EMSA):
　　 收集各組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞核蛋白，檢測細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。
　　 研究結(jié)果
　

9、　 1.低剪切力誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)iNOS和ICAM-1mRNA和蛋白的表達(dá)具有時(shí)間依賴性:
　　 應(yīng)用低剪切力(0.4Pa)刺激HUVECs0h、4h、8h、12h、16h、24h和36h，RT-PCR和蛋白印記結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LSS能夠誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞內(nèi)iNOS和ICAM-1的表達(dá)。在LSS刺激4h后，iNOSmRNA和蛋白表達(dá)開始升高;在LSS刺激12h后，iNOSmRNA和蛋白達(dá)到峰值，此時(shí)ICAM-

10、1mRNA和蛋白的表達(dá)也明顯升高。
　　 2.LSS刺激增加了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中PARP-1的蛋白表達(dá)和活性:
　　 與正常對照組相比，LSS能夠顯著增加細(xì)胞中PARP-1蛋白的表達(dá)量，而PARP-1的siRNA可以下調(diào)PARP-1的表達(dá);此外，LSS刺激能增加PARP-1的活性，即上調(diào)PAR的生成，加入PARP-1抑制劑ABT888或siRNA后，PAR的生成明顯減少。
　　 3.LSS刺激增加了細(xì)胞中超氧陰離子

11、(O2-)和3-NT的合成:
　　 為了顯示細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，我們檢測了細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子和硝基酪氨酸的合成。DHE染色和蛋白印記結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LSS刺激下的HUVECs細(xì)胞，O2-的合成和3-NT的表達(dá)明顯增加。
　　 4.LSS刺激引起細(xì)胞DNA損傷:
　　 彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低剪切力刺激能顯著增加尾部DNA的含量，而靜態(tài)條件下尾部幾乎沒有DNA;此外，LSS還能增加細(xì)胞中p-H2A-X的表達(dá)

12、，說明了LSS刺激能誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷。
　　 5.LSS能夠通過MEK/ERK通路激活PARP-1:
　　 與正常對照組相比，LSS能夠活化JNK、p38和ERK通路，增加其磷酸化蛋白的表達(dá)。應(yīng)用SP600125、SB203580、U0126抑制劑能夠抑制JNK、p38、ERK的磷酸化，但是只有MEK/ERK抑制劑U0126能夠減少PAR的生成。
　　 6.抑制PARP-1能夠減少炎癥因子iNOS和ICAM-1

13、的表達(dá):
　　 蛋白印跡結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LSS刺激能夠顯著增加iNOS和ICAM-1的蛋白表達(dá)量;應(yīng)用ABT888或siRNA抑制PARP-1后，炎癥因子的表達(dá)明顯減少。
　　 7.抑制PARP-1通過上調(diào)胞內(nèi)NAD+的水平而上調(diào)Sirt1的活性:
　　 與正常對照組相比，LSS刺激能夠顯著減少細(xì)胞內(nèi)NAD+的水平和Sirt1的活性;抑制PARP-1后，細(xì)胞內(nèi)NAD+水平明顯升高，伴隨Sirt1活性的

14、增加，而其蛋白表達(dá)量沒有明顯變化。
　　 8.抑制PARP-1通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和活性而減少炎癥因子的表達(dá):
　　 免疫熒光結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)下，NF-κB的亞單位p65主要存在于胞漿中，而LSS刺激能夠誘導(dǎo)p65亞基的核轉(zhuǎn)位;抑制PARP-1后，LSS誘導(dǎo)的p65亞基核轉(zhuǎn)位受到明顯抑制。EMSA結(jié)果顯示，LSS刺激能夠增加NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，而抑制PARP-1能夠顯著降低NF-κB的活性。此外，蛋白印跡結(jié)果顯

15、示，LSS能減少IkBα的表達(dá)，增加p65亞基的磷酸化;而抑制PARP-1能夠減少p65亞基的磷酸化，對IkBα的表達(dá)無顯著作用。
　　 結(jié)論及意義
　　 1.低剪切力能夠誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng);
　　 2.低剪切力能夠引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和DNA損傷;
　　 3.低剪切力可以通過MEK/ERK途徑激活PARP-1;
　　 4.抑制PARP-1能夠減輕LSS誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，這一

16、作用主要通過以下兩個(gè)機(jī)制實(shí)現(xiàn):(1)上調(diào)胞內(nèi)NAD+水平而增加Sirt1的活性;(2)抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和活性，以及p65亞基的磷酸化。
　　 5.在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們對PARP-1在低剪切力誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中的作用及其機(jī)制做了系統(tǒng)的闡述，相關(guān)結(jié)果提示聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1或許是治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的靶基因。
　　 論文Ⅱ
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1基因干預(yù)對低剪切力誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成

17、的作用及機(jī)制研究
　　 研究背景及目的
　　 在西方發(fā)達(dá)國家，動(dòng)脈粥樣硬化性疾病依然是患病率和死亡率的首要原因。隨著我國人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，動(dòng)脈粥樣硬化(AS)也成為我國人民的主要死亡原因。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病是多因素的，深入的了解動(dòng)脈粥樣硬化對其早期預(yù)防和治療具有重要的意義。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化通常被認(rèn)為是一種系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病機(jī)制與許多經(jīng)典的危險(xiǎn)因素密切相關(guān)，如高血壓，高血脂，糖尿病和吸煙等。動(dòng)

18、脈粥樣硬化斑塊好發(fā)于血管彎曲、分叉和分支部位，提示血流動(dòng)力和血管形態(tài)在斑塊形成中發(fā)揮了重要的作用。許多體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)研究了血管中血流的狀態(tài)并尋找斑塊好發(fā)部位與血流動(dòng)力學(xué)之間的可能聯(lián)系。隨著研究的不斷深入，剪切力在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的作用日益受到重視。
　　 在平直血管中，血液在各處血管的流速是不一致的。在血管軸心處血液流速最快，越靠近血管壁流速越慢。流動(dòng)的血液會(huì)與血管發(fā)生摩擦，這種摩擦?xí)a(chǎn)生一種平行作用于血管內(nèi)膜的力，稱為剪切

19、力(WSS)。剪切力是一種十分重要的血流動(dòng)力，它能夠引起血管活性物質(zhì)的釋放，改變基因的表達(dá)、細(xì)胞代謝和細(xì)胞形態(tài)等。
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是PARP家族中含量最多的一種高度保守的核蛋白。氧化應(yīng)激引起的DNA損傷能夠激活PARP-1。在細(xì)胞核中，活化的PARP-1催化裂解NAD+為ADP核糖并將其轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。在正常情況下，PARP-1參與了DNA損傷的修復(fù);但是在病理?xiàng)l件下，PARP-1的過度活化會(huì)引起

20、細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP的耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞能量危機(jī)和功能障礙甚至死亡。大量研究證實(shí)PARP-1的過度激活與各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如休克、心衰、缺血再灌注損傷和糖尿病等。
　　 在以往研究的基礎(chǔ)上，我們提出如下假設(shè):1）在動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期，抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠延緩低剪切力誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成;2）抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1減少低剪切力誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。
　　

21、 本研究正是基于以上思路，在小鼠體內(nèi)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證這一假說。旨在探討PARP-1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用，以期為抑制斑塊形成、預(yù)防心血管急性事件的發(fā)生防治尋找新的契機(jī)和治療靶點(diǎn)。
　　 研究方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
　　 先將ApoE和PARP-1敲基因小鼠合籠繁殖得到ApoE+-PARP-1+/-小鼠，然后將ApoE+/-PARP-1+/-雜合子合籠繁殖，應(yīng)用PCR鑒定其子代基因型，最后得到ApoE-

22、/-PARP-1-/-雙基因敲除小鼠。
　　 2.動(dòng)物模型的建立:
　　 8周齡雄性ApoE和ApoE/PARP-1敲基因小鼠，采用高脂喂養(yǎng)+右側(cè)頸動(dòng)脈套管的方法，構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為三組:對照組，ApoE敲基因小鼠胃飼生理鹽水;抑制劑組，ApoE敲基因小鼠胃飼PARP-1抑制劑ABT888;敲基因組，ApoE/PARP-1敲基因小鼠。
　　 3.聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的干預(yù):
　　 采

23、用基因敲除和聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1抑制劑ABT888降低PARP-1基因表達(dá)。
　　 4.心率和血壓:
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)用無創(chuàng)方法檢測各組小鼠的心率和血壓。
　　 5.血脂參數(shù):
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集小鼠血清，檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平。
　　 6.H&E和油紅O染色:
　　 收集左側(cè)頸動(dòng)脈和右側(cè)

24、頸動(dòng)脈近心端，制備小鼠頸動(dòng)脈切片，進(jìn)行H&E和油紅O染色，分別顯示斑塊的大體結(jié)構(gòu)和斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量。
　　 7.免疫熒光檢測:
　　 制備小鼠頸動(dòng)脈近心端切片，進(jìn)行免疫熒光染色，檢測斑塊組織內(nèi)炎性因子ICAM-1的表達(dá)情況。
　　 8.蛋白印跡:
　　 收集頸動(dòng)脈近心端，提取蛋白，用于檢測組織內(nèi)聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的蛋白及其活性、炎性因子ICAM-1的表達(dá)量。
　　 9.DHE染色:
　　

25、 收集小鼠頸動(dòng)脈，制備頸動(dòng)脈切片，用于檢測斑塊內(nèi)超氧化物陰離子的生成量。
　　 研究結(jié)果
　　 1.各組小鼠的一般情況:
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測各組小鼠心率、血壓和血脂水平，結(jié)果顯示各組小鼠心率、血壓、血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的濃度水平無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果提示PARP-1基因干預(yù)抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成與血脂之間沒有直接關(guān)系。
　　 2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠減少低剪切力誘

26、導(dǎo)的頸動(dòng)脈斑塊形成:
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們應(yīng)用H&E和油紅O染色檢測各組小鼠頸動(dòng)脈斑塊及脂質(zhì)的形成情況。與正常對照組的生理剪切力（左側(cè)頸動(dòng)脈）相比，低剪切力（右側(cè)近心端）明顯促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和脂質(zhì)的生成(p＜0.05，VS.生理剪切力)。與對照組低剪切力相比，PARP-1抑制或敲除明顯抑制了實(shí)驗(yàn)組套管側(cè)近心端斑塊的形成和脂質(zhì)的含量(p＜0.05，VS.對照組低剪切力)。
　　 3.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠

27、抑制低剪切力誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng):
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們檢測小鼠頸動(dòng)脈炎癥因子ICAM-1的表達(dá)情況。免疫熒光結(jié)果顯示，與生理剪切力（對照組左側(cè)頸動(dòng)脈）相比，低剪切力（對照組套管近心端）能夠明顯促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)(p＜0.05，VS.生理剪切力);而在各實(shí)驗(yàn)組中，PARP-1抑制或敲除能夠明顯抑制低剪切力誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)(p＜0.05，VS.對照組低剪切力)。蛋白印跡顯示了類似的結(jié)果，且基因敲除引起的效果較抑制劑明顯。這些

28、結(jié)果說明抑制PARP-1減少低剪切力誘導(dǎo)的斑塊形成是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。
　　 4.低剪切力能夠增加聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表達(dá)和活性:
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們檢測了小鼠頸動(dòng)脈中PARP-1和PAR的表達(dá)情況。蛋白印跡結(jié)果顯示，與生理剪切力（對照組左側(cè)頸動(dòng)脈）相比較，低剪切力（對照組套管近心端）能夠明顯增加PARP-1和PAR的表達(dá)量(p＜0.05，VS.對照組生理剪切力)。在實(shí)驗(yàn)組套管側(cè)近心端，抑制劑組

29、小鼠PARP-1的表達(dá)無明顯變化，而PAR的表達(dá)明顯下降;雙基因敲除組小鼠體內(nèi)沒有PARP-1和PAR的表達(dá)(p＜0.05，VS.對照組低剪切力)。
　　 5.低剪切力能夠增加氧化應(yīng)激反應(yīng):
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們應(yīng)用DHE染色顯示組織中超氧陰離子的形成狀況。DHE染色結(jié)果顯示，與生理剪切力（對照組左側(cè)）相比，低剪切力（對照組套管近心端）能夠明顯增加組織超氧陰離子的生成，且PARP-1基因敲除或抑制對此沒有明顯影響。

30、r>　　 結(jié)論及意義
　　 1.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠減輕低剪切力誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成;
　　 2.抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠減輕低剪切力誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng);
　　 3.低剪切力能夠增加聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表達(dá)和活性;
　　 4.低剪切力能夠增加氧化應(yīng)激;
　　 5.該研究為進(jìn)一步闡明PARP-1在AS斑塊形成中的作用和機(jī)理，從而為相關(guān)的心血管急性事件的防治提供新的思

31、路及有效的治療靶點(diǎn)。
　　 論文Ⅲ
　　 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究
　　 研究背景及目的
　　 糖尿病(DM)是一種代謝綜合征，以機(jī)體相對或絕對胰島素不足或胰島素抵抗而出現(xiàn)高血糖為特征。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全球約有1億8千萬糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2025年這一數(shù)字將增加到3億。隨著人民生活水平的改善和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國糖尿病的患病率也達(dá)到了相當(dāng)高的水平，大約是9.7％。

32、>　　 由冠狀動(dòng)脈病變和高血壓引起的心血管疾病(CAD)是糖尿病患者死亡的首要病因。然而，科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在冠心病和高血壓等危險(xiǎn)因素不存在的情況下，糖尿病患者也出現(xiàn)了心衰癥狀，臨床上將導(dǎo)致上述現(xiàn)象出現(xiàn)的疾病稱為糖尿病心肌病(DCM)。作為糖尿病的早期并發(fā)癥，糖尿病心肌病能夠?qū)е滦募∈湛s和舒張功能異常。盡管糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制仍然不明確，但是氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮了重要的作用。高血糖引起的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)微血管病變的發(fā)生，導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡、肥大、

33、纖維化和功能障礙。此外，氧化應(yīng)激引起DNA鏈的斷裂并激活了聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP-1）。
　　 PARP-1是PARP家族中研究最為廣泛的一種核酶。PARP-1具有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、自我修飾結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域。正常情況下，PARP-1參與了機(jī)體DNA損傷的修復(fù)和遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定。然而，當(dāng)PARP-1被過度激活時(shí)，它會(huì)快速消耗胞內(nèi)NAD以便將聚ADP核糖轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。為了重新合成NAD，細(xì)胞會(huì)過度消耗A

34、TP，從而導(dǎo)致能量耗竭和細(xì)胞死亡。
　　 抑制PARP-1可以減少細(xì)胞能量消耗而減少細(xì)胞死亡。此外，最近研究顯示抑制PARP-1還能夠誘導(dǎo)Akt磷酸化，激活抗凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在心臟中，胰島素樣因子1(IGF-1)可以通過誘導(dǎo)胰島素樣因子1受體的磷酸化保護(hù)心臟功能，而后者的磷酸化能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路。
　　 在以往研究的基礎(chǔ)上，我們提出如下假設(shè):1）抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1能夠減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡;

35、2）抑制聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1減少凋亡的作用是通過激活I(lǐng)GF-1R/Akt信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。
　　 本研究正是基于以上思路，我們設(shè)計(jì)了體外實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證這一假說。旨在探討聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在糖尿病心肌細(xì)胞凋亡中的作用和可能機(jī)制，以期尋找到糖尿病心肌病新的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。
　　 材料與方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立:
　　 應(yīng)用DMEM培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞，以低糖(5.5mM)和高糖(33mM)

36、分別刺激細(xì)胞。
　　 2.基因和蛋白表達(dá)的干預(yù):
　　 體外采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PARP-1siRNA的方式抑制PARP-1的基因表達(dá);分別應(yīng)用IGF-1和PPP以促進(jìn)或抑制IGF-1R的磷酸化水平。
　　 3.激光共聚焦顯微鏡:
　　 分別檢測大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子(O2-)和活性氧簇(ROS)的含量。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù):
　　 檢測各刺激組心肌細(xì)胞的凋亡水平。
　　 5.實(shí)時(shí)定量

37、逆轉(zhuǎn)錄PCR(Real-timeRT-PCR):
　　 檢測大鼠心肌細(xì)胞中PARP-1的基因表達(dá)水平。
　　 6.蛋白印跡(westernblottinganalysis):
　　 分別檢測大鼠心肌細(xì)胞中PARP-1蛋白，IGF-1R和Akt蛋白的磷酸化水平。
　　 研究結(jié)果
　　 1.高糖誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激具有時(shí)間依賴性:
　　 應(yīng)用高糖DMEM(33mM)分別刺激大鼠心肌細(xì)胞2

38、4h、36h和48h，應(yīng)用DHE和DCF進(jìn)行細(xì)胞染色，激光共聚焦顯微鏡拍片檢測細(xì)胞中超氧陰離子和ROS的生成水平。結(jié)果顯示，應(yīng)用高糖刺激24h后，心肌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平與正常對照組(5.5mM)相當(dāng);應(yīng)用高糖刺激36h，與正常對照組相比，超氧陰離子和ROS的生成分別增加了將近1倍和3倍(p＜0.05，VS.control);應(yīng)用高糖刺激48h后，超氧陰離子和ROS的生成分別增加了將近3倍和4倍(p＜0.01，VS.control)。<

39、br>　　 2.高糖刺激增加了心肌細(xì)胞內(nèi)PARP-1的表達(dá)和活性:
　　 分別應(yīng)用高糖刺激心肌細(xì)胞24h、36h和48h后，檢測細(xì)胞中PARP-1的表達(dá)與活性水平。RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對照相比，高糖刺激24h后PARP-1基因表達(dá)無明顯變化，高糖刺激36h和48h能夠明顯增加心肌細(xì)胞中PARP-1的基因表達(dá)量。蛋白印跡結(jié)果顯示，高糖刺激24h后PARP-1和PAR蛋白表達(dá)無明顯變化，高糖刺激36h和48h明顯增加了PA

40、RP-1和PAR蛋白的表達(dá)量，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。這些結(jié)果顯示高糖能夠增加PARP-1的表達(dá)和活性。
　　 3.PARP-1siRNA減少了PARP-1基因和蛋白的表達(dá)量:
　　 實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用了PARP-1的siRNA來抑制PARP-1的表達(dá)，并用RT-PCR和蛋白印跡的實(shí)驗(yàn)方法檢測了干擾效率。RT-PCR結(jié)果顯示與正常對照相比，PARP-1siRNA明顯減少了PARP-1基因的表達(dá);蛋白印跡結(jié)果顯示應(yīng)用PARP-1si

41、RNA使PARP-1蛋白表達(dá)量減少到正常對照的一半。PARP-1siRNA的陰性對照對其基因和蛋白表達(dá)沒有明顯影響。這些結(jié)果顯示PARP-1siRNA能有效抑制PARP-1的表達(dá)。
　　 4.抑制PARP-1減少了高糖誘導(dǎo)的胞內(nèi)NAD+消耗:
　　 一旦被DNA損傷激活，PARP-1就會(huì)以胞內(nèi)NAD+為底物進(jìn)行聚ADP核糖化反應(yīng)。我們應(yīng)用NAD檢測試劑盒測定各組細(xì)胞NAD+的水平。分光光度結(jié)果顯示與正常對照組相比，高糖能

42、夠明顯降低胞內(nèi)NAD+的含量;而抑制PARP-1能夠減少高糖誘導(dǎo)的NAD+消耗。這些結(jié)果說明PARP-1參與了高糖誘導(dǎo)的胞內(nèi)NAD+消耗。
　　 5.抑制PARP-1減少了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡:
　　 隨后我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了各種心肌細(xì)胞的凋亡狀況。結(jié)果顯示與正常對照相比，高糖能夠增加細(xì)胞的凋亡水平;應(yīng)用IGF-1能夠減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而PPP卻能夠增加高糖引起的細(xì)胞凋亡;抑制PARP-1后，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)

43、胞凋亡水平明顯減少。這些結(jié)果顯示，與IGF-1一樣，抑制PARP-1也能夠減少心肌細(xì)胞凋亡。
　　 6.抑制PARP-1增加了Akt磷酸化水平:
　　 在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們研究了抑制PARP-1減少細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制?？紤]到Akt在抗凋亡中的重要作用，我們檢測了細(xì)胞中Akt的表達(dá)。蛋白印跡結(jié)果顯示，各組細(xì)胞總Akt的表達(dá)沒有明顯變化;但是與高糖刺激組相比，應(yīng)用IGF-1和PARP-1siRNA能夠增加Akt的磷酸化水平

44、;應(yīng)用PPP卻減少了磷酸化Akt的表達(dá)。這些結(jié)果顯示Akt參與了抗凋亡機(jī)制。
　　 7.抑制PARP-1增加了IGF-1R的磷酸化水平:
　　 隨后我們檢測了IGF-1R的表達(dá)量。蛋白印跡結(jié)果顯示，各組細(xì)胞總的IGF-1R表達(dá)沒有明顯變化;但是與高糖刺激組相比，應(yīng)用PPP減少了磷酸化IGF-1R的表達(dá)，應(yīng)用IGF-1和PARP-1siRNA卻能夠增加IGF-1R的磷酸化水平。這些結(jié)果顯示抑制PARP-1減少凋亡是通過激活