過(guò)表達(dá)整合素連接激酶通過(guò)NF-kB信號(hào)途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：
　　研究整合素連接激酶在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用、可能涉及的信號(hào)通路及其作用機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)和試劑
　　人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心（中國(guó)，上海）購(gòu)買并保存于37℃、5％ CO2、飽和濕度環(huán)境下Leibovitz's L-15培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY, USA)，培養(yǎng)基含10％胎牛血清(FBS; HyClone，Logan，UT,

2、USA)和抗體。細(xì)胞用胰蛋白酶處理，常規(guī)每2-3天傳代一次。為了抑制NF-κB的活性，將10μmol/LBAY11-7082(Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen，China)加入培養(yǎng)基反應(yīng)2天時(shí)間。
　　2、質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
　　人ILK基因的編碼序列(NCBI Reference Sequence: NM004517.2)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，并將之導(dǎo)入pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)

3、粒之中。合適的序列以及定位通過(guò)直接的DNA序列來(lái)確定。轉(zhuǎn)染前1日，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞將SW480細(xì)胞接種于6孔板。細(xì)胞通過(guò)脂質(zhì)體2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)用2μg ILK表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或2μg對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基(G418，800mg/mL)內(nèi)培養(yǎng)3-4周。選取G418抗性克隆，通過(guò)RT-PCR和Western blot分析確認(rèn)后進(jìn)行擴(kuò)增。
　　3、RNA干擾

4、>　　NF-κB p65(5'-CCUCCUUUCAGGAGAUGAATT-3')的雙鏈寡核苷酸小干擾RNA以及錯(cuò)義對(duì)照(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')由中國(guó)上海吉瑪公司抗體(稀釋1∶1000)、抗IκBα抗體(稀釋1∶1000)、抗磷酸化IκBα抗體(稀釋1∶1000)、抗vimentin抗體(稀釋1∶1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA，USA)，抗E-

5、cadherin抗體(稀釋1∶500)、抗Snail抗體(稀釋1∶500)、抗Slug抗體(稀釋∶1000; Abcam，Cambridge，MA，USA)和抗β-actin抗體(稀釋1∶5000，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)孵化，之后再用辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)二抗處理。利用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore)可見(jiàn)特異性的蛋白條帶。
　　7、免疫熒光檢測(cè)
　　細(xì)胞生長(zhǎng)于玻璃顯微鏡蓋玻片上，用4

6、％多聚甲醛固定并用0.1％tritonX-100透性化。之后，一抗E-cadherin用PBS按1∶100稀釋，滴加至完全覆蓋細(xì)胞，4℃過(guò)夜。滴加熒光二抗FITC標(biāo)記山羊抗兔抗體。清除二抗，滴加DAPI至完全覆蓋細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡觀察染色效果(FV1000S-SIM/IX81;Olympus，Tokyo，Japan)。
　　8、劃痕實(shí)驗(yàn)
　　SW480細(xì)胞加至6孔板中直至達(dá)到預(yù)定濃度。棄去培養(yǎng)基4小時(shí)，利用200μl移液

7、管的尖端制造細(xì)胞劃痕。之后，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面去除細(xì)胞碎片，用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕分別于0小時(shí)、6小時(shí)以及12小時(shí)拍照。計(jì)算細(xì)胞遷徙距離與原始劃痕寬度的比值。
　　9、跨膜實(shí)驗(yàn)
　　使用預(yù)涂含有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基質(zhì)聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯膜(8μm pores; BDBio-sciences，San Jose，CA，USA)的Boyden小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲評(píng)價(jià)。將含有3×105個(gè)細(xì)胞的500μl無(wú)血清培養(yǎng)基加到小室的上部

8、，將800μl的細(xì)胞培養(yǎng)基(10％ FBS)加到小室的底部作為化學(xué)引誘物。37℃孵育24小時(shí)，用棉簽擦去微孔膜上層細(xì)胞，以多聚甲醛于室溫下固定20 min，蘇木素染液染色。在倒置相差顯微鏡下對(duì)遷移至微孔膜下層的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　　10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析以及Bonferroni事后檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、　　結(jié)果：
　　1、pcDNA3.1-ILK質(zhì)粒可成功轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞系并表達(dá)。
　　2、過(guò)表達(dá)ILK可增強(qiáng)SW480細(xì)胞系的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　3、過(guò)表達(dá)ILK可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞系發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　4、過(guò)表達(dá)ILK誘導(dǎo)SW480細(xì)胞系發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中有賴于NF-κB信號(hào)通路。
　　結(jié)論：
　　過(guò)表達(dá)ILK可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞系發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移能力。在過(guò)表達(dá)ILK誘導(dǎo)