蘋果提取物與葉黃素對食管癌細(xì)胞的抗癌活性及標(biāo)志物篩選.pdf

1、食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。對食管癌和其它癌癥尋求預(yù)防和治療途徑，減少癌癥對人類健康的威脅是一項(xiàng)重要的工作。植物化學(xué)物為植物性食品中天然存在、含量較少的一類具有抗氧化、抗癌、減少脂質(zhì)過氧化和降低膽固醇等生理活性的化學(xué)物質(zhì)。尋找植物中抗癌成份進(jìn)行食管癌的預(yù)防及治療具有十分重要的意義。 流行病學(xué)研究表明蔬菜水果的消費(fèi)與降低心血管疾病以及某些癌癥的危險(xiǎn)有關(guān)。水果和蔬菜中的植物化學(xué)物尤其是酚類作為主要的生物活性物質(zhì)，在對健康的保

2、護(hù)方面起著重要作用。類黃酮屬于多酚類化合物家族，廣泛存在于水果、蔬菜、茶葉等各類植物之中，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗過敏、消炎、抑菌、抑制腫瘤生長等作用。近年來一些調(diào)查結(jié)果表明，人類每天從膳食中攝入相當(dāng)數(shù)量的類黃酮，其攝入量甚至超過了一些微量營養(yǎng)素。 蘋果中富含植物化學(xué)物如類黃酮及多酚類，實(shí)驗(yàn)室研究顯示蘋果提取物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可以減少脂質(zhì)過氧化，降低膽固醇以及抑制結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明蘋果提取物可以預(yù)

3、防乳腺腫瘤的發(fā)生。雖然流行病學(xué)研究結(jié)果提示蘋果的消費(fèi)與降低腫瘤的危險(xiǎn)性有關(guān)，一些體外和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蘋果提取物對某些腫瘤具有抑制作用，但對其復(fù)雜多樣的作用機(jī)制還不甚了解，需進(jìn)行深入的研究加以闡明。葉黃素(lutein)屬于類胡蘿卜素，流行病學(xué)研究表明，在預(yù)防視黃斑退化、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、心血管疾病和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面有著廣泛的生物學(xué)活性。水果蔬菜中天然存在的植物化合物的聯(lián)合作用在抗氧化以及腫瘤預(yù)防方面至關(guān)重要。通過蘋果中類黃酮物

4、質(zhì)含量的檢測以及探討蘋果提取物和葉黃素抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，以及作用于腫瘤細(xì)胞后在基因和蛋白水平發(fā)生的變化，對于揭示水果蔬菜預(yù)防腫瘤的作用機(jī)制以及開發(fā)研制復(fù)合型保健品具有重要的理論和實(shí)際意義。 由于食管癌是嚴(yán)重危害人體健康的惡性腫瘤，尋找對其干預(yù)和治療的措施非常重要。流行病學(xué)研究表明蔬菜和水果的消費(fèi)與腫瘤發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，但其作用機(jī)制尚未闡明。蘋果中含有豐富的類黃酮，為了解蘋果中類黃酮的含量水平、蘋果提取物和葉黃素的抗腫瘤效應(yīng)以

5、及作用機(jī)制，以期為食管癌的膳食預(yù)防和腫瘤的輔助治療提供參考。本課題選用蘋果提取物和葉黃素作為處理因素，利用食管癌細(xì)胞建造體外模型，采用MTT法、流式細(xì)胞儀、免疫組織化學(xué)、westernblot、DDRT-PCR和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，從蘋果提取物含量化學(xué)分析入手，以細(xì)胞增殖和凋亡事件為切入點(diǎn)，對細(xì)胞周期，凋亡誘導(dǎo)，差異基因乃至差異蛋白表達(dá)情況進(jìn)行系統(tǒng)的研究，對蘋果提取物和葉黃素抗食管癌作用及其機(jī)制進(jìn)行深入探討，同時(shí)篩選其作用的靶分子，為食管

6、癌的預(yù)防及低毒抗癌藥物的研制提供理論依據(jù)。 方法： 全文共分五個(gè)部分，主要研究方法及內(nèi)容如下： 第一部分蘋果提取物的制備和檢測。采用溶劑提取法從蘋果樣本中提取可溶性黃酮類物質(zhì)制備蘋果提取物，鋁離子顯色法檢測其中的總黃酮含量。 第二部分蘋果提取物與葉黃素對食管癌細(xì)胞周期和分化的影響。用不同濃度的蘋果提取物和葉黃素處理EC9706細(xì)胞，采用MTT法，觀察對細(xì)胞增殖抑制的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，免疫組

7、織化學(xué)的方法檢測周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1表達(dá)情況。 第三部分蘋果提取物與葉黃素對食管癌細(xì)胞凋亡的影響。用不同濃度的蘋果提取物和葉黃素處理EC9706細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)和原位細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)，觀察對細(xì)胞凋亡的影響，免疫組織化學(xué)方法和Western印跡雜交技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)情況。 第四部分蘋果提取物對食管癌細(xì)胞作用的差異基因表達(dá)。采用熒光標(biāo)記mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)對處理組和對

8、照組差異基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，篩選差異表達(dá)基因并進(jìn)行克隆與測序鑒定。以探討蘋果提取物對食管癌細(xì)胞作用后基因水平的分子變化。 第五部分蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選標(biāo)志物。以蘋果提取物作用于體外培養(yǎng)的人食管癌EC9706細(xì)胞為模型，采用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)篩選作用后在食管癌細(xì)胞中表達(dá)的差異蛋白質(zhì)，旨在為闡明蘋果提取物對食管癌細(xì)胞的作用及其抗癌的分子機(jī)制，以及為進(jìn)一步探討腫瘤治療標(biāo)志物提供依據(jù)。 結(jié)果： 1．對9種新鮮水果提取物

9、總黃酮檢測表明，總黃酮的含量范圍為40．11mg/100g～122．88mg/100g。由高到低依次為：紅富士蘋果、沙梨、黃金梨、香梨、豐水梨、紅橙、碭山梨、水晶梨和獼猴桃。 2．在體外實(shí)驗(yàn)條件下蘋果提取物和葉黃素均顯示出抑制食管癌EC9706細(xì)胞增殖的作用。蘋果提取物通過抑制細(xì)胞DNA合成，降低了細(xì)胞周期中S期百分率，使細(xì)胞停滯于G<,2>/M期，葉黃素則使細(xì)胞停滯于G<,0>/G<,1>期，并抑制了Cyclin D1的表達(dá)。

10、葉黃素作用后使食管癌增殖型細(xì)胞減少，分化型細(xì)胞增多，誘導(dǎo)了良性分化。 3．蘋果提取物和葉黃素均可誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡，同步分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)結(jié)果顯示，蘋果提取物和葉黃素可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)及上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。 4．采用DDRT-PCR技術(shù)對蘋果提取物作用于食管癌細(xì)胞后的差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測，獲得了差異表達(dá)指紋圖譜，經(jīng)克隆和測序獲得了差異表達(dá)片段的基因序列。這些差異表達(dá)的基因序

11、列主要涉及SET結(jié)構(gòu)域和PDZ結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞周期生長調(diào)節(jié)、參與細(xì)胞有絲分裂的腫瘤蛋白D52以及與腫瘤發(fā)生有關(guān)的甲硫氨酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ。 5．采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測蘋果提取物作用后的差異表達(dá)蛋白，獲得了差異表達(dá)蛋白的雙向凝膠電泳圖譜，用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MOLDI-TOF-MS)鑒定了18個(gè)差異蛋白的肽指紋圖譜，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索匹配，篩選出了一些相關(guān)蛋白，分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白功能涉及細(xì)胞代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架組成、氧化應(yīng)

12、激、免疫、細(xì)胞增殖和凋亡以及分子伴侶等方面。這些生物標(biāo)志物主要有：微管去穩(wěn)蛋白、微管蛋白伴侶分子、蛋白激酶C抑制劑、泛素、HMG B1、異質(zhì)性核內(nèi)核糖核蛋白、微管蛋白分子伴侶和醛縮酶A。 結(jié)論： 1．所檢測的9種水果中均存在黃酮類化合物，但在不同種類的水果中差別較明顯。與其它水果相比蘋果總黃酮含量較高，是膳食黃酮類化合物的重要來源。 2．蘋果提取物和葉黃素在一定濃度范圍內(nèi)均可抑制食管癌EC9706細(xì)胞增殖，表明具

13、有抗癌作用。干擾食管癌細(xì)胞周期，降低分裂期細(xì)胞可能是其抗癌機(jī)制之一。對細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白Cyclin D1表達(dá)水平的檢測表明，經(jīng)葉黃素作用后，其表達(dá)水平降低，揭示葉黃素通過調(diào)節(jié)Cyclin D1表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而使食管癌EC9706細(xì)胞阻滯于G<,0>/G<,1>期，可能是葉黃素抑制食管癌細(xì)胞增殖的另一重要機(jī)制。葉黃素還具有促進(jìn)細(xì)胞分化潛能，有助于延緩細(xì)胞生長，降低惡性程度。 3．蘋果提取物和葉黃素抑制EC9706細(xì)胞

14、增殖的作用伴隨著對凋亡的誘導(dǎo)和細(xì)胞循環(huán)周期的阻滯，研究結(jié)果提示蘋果提取物和葉黃素通過介導(dǎo)Bax和Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生，是其誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制之一。 4．DDRT-PCR分析表明，差異表達(dá)的基因序列主要涉及SET。結(jié)構(gòu)域、PDZ結(jié)構(gòu)域，揭示了蘋果提取物在基因水平上的影響涉及到跨膜受體或離子通道蛋白，與細(xì)胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)間相互作用有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。進(jìn)而可影響到蛋白質(zhì)定位、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白復(fù)合體的組裝等方面

15、。從基因水平進(jìn)一步深入探討了蘋果提取物的抗癌作用機(jī)制。研究中發(fā)現(xiàn)蘋果提取物作用后，可使食管癌EC9706細(xì)胞周期停滯于G<,2>/M期，抑制細(xì)胞增殖，這種抑制作用機(jī)制可能與D52表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的抑制細(xì)胞有絲分裂有一定的聯(lián)系。蘋果提取物還可能通過抑制與細(xì)胞的生長、去分化和癌癥有關(guān)的甲硫氨酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。 5．經(jīng)蘋果提取物作用后，與細(xì)胞代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架組成、氧化應(yīng)激、免疫、細(xì)胞增殖和凋亡以及分子伴侶有關(guān)的

16、多種蛋白表達(dá)水平發(fā)生了變化。提示蘋果提取物可作用于細(xì)胞代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激等多種途徑。鑒定的蛋白質(zhì)可以作為蘋果提取物作用的生物標(biāo)志物，同時(shí)有可能成為臨床上治療食管癌藥物作用的靶分子。蘋果提取物調(diào)節(jié)微管去穩(wěn)蛋白和微管蛋白伴侶分子表達(dá)，可影響細(xì)胞有絲分裂阻止腫瘤細(xì)胞生長：蘋果提取物上調(diào)蛋白激酶C抑制劑，提示PKCI途徑可能是蘋果提取物發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一；對腫瘤細(xì)胞的作用與抑制泛素一蛋白酶體途徑，去泛素化作用有關(guān)，潛在的機(jī)制可能涉及

17、泛素一蛋白酶體途徑介導(dǎo)的IkB降解，進(jìn)而阻斷NF-kB的活化，影響細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)過程；蘋果提取物的抗氧化，預(yù)防氧化應(yīng)激損傷與HMC蛋白有關(guān)，其抗氧化、抗炎的機(jī)制可能是通過HMC介導(dǎo)的；蘋果提取物與蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑染料木黃酮作用相同的是，可下調(diào)異質(zhì)性核內(nèi)核糖核蛋白和上調(diào)微管去穩(wěn)蛋白，表明這兩種蛋白是它們作用的共同靶分子，提示蘋果提取物可能具有酪氨酸激酶抑制劑作用；蘋果提取物下調(diào)微管蛋白分子伴侶，這一作用類似抗腫瘤藥物紫杉醇，微管蛋

18、白分子伴侶是其作用的靶分子。蘋果提取物可抑制醛縮酶A表達(dá)，醛縮酶A是肝癌診斷的標(biāo)志物，也是藥物作用的靶分子。提示蘋果提取物在作用和途徑上與某些抗腫瘤藥物類似。 6．綜合研究結(jié)果表明蘋果提取物和葉黃素作用后導(dǎo)致的細(xì)胞生長抑制、誘導(dǎo)凋亡與基因和蛋白表達(dá)的改變之間有著潛在的聯(lián)系。由于蘋果提取物中黃酮類化學(xué)物的綜合作用，調(diào)節(jié)了多種基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而經(jīng)由細(xì)胞代謝、信號通路、氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)等多途徑，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖的抑制和促進(jìn)凋