骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化心臟瓣膜構(gòu)成細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立可以在體外穩(wěn)定地獲得大量高純度內(nèi)皮細(xì)胞的簡便方法,并對(duì)獲得細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察及表面標(biāo)志鑒定。
　　 材料和方法:1.取4周齡SD大鼠,雌雄不拘,無菌條件下提取原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,體外通過全髓貼壁法培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增,將獲得的P3-BMSCs采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表面抗原鑒定,應(yīng)用的抗體為CD29和CD34。2.取P3-BMSCs分為2組:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在L-DMEM(20％FBS+10ng/ml VEGF)條

2、件下培養(yǎng)14d；對(duì)照組細(xì)胞以未加特殊誘導(dǎo)劑的L-DMEM+10％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)14d；每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,培養(yǎng)到7d和14d時(shí)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞爬片,用Anti-FactorⅧ進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。
　　 結(jié)果:1.通過全髓貼壁法可獲得均質(zhì)性較好的細(xì)胞,獲得的細(xì)胞培養(yǎng)到第3代時(shí)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn),細(xì)胞表達(dá)CD29的陽性率超過96％,而不表達(dá)CD34；BMSCs為均一的長梭形,漩渦狀、團(tuán)簇狀生長,在體外增殖

3、能力強(qiáng)。2.實(shí)驗(yàn)組P3-BMSCs經(jīng)L-DMEM(20％FBS+10ng/ml VEGF)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞逐漸變的粗大,10d左右倒置顯微鏡下出現(xiàn)明顯的“鵝卵石”樣形態(tài),而對(duì)照組仍為均一的長梭形,漩渦狀、團(tuán)簇狀生長,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)7d和14d的細(xì)胞表達(dá)Anti-FactorⅧ的陽性率分別為8296和93％,而對(duì)照組細(xì)胞陰性表達(dá).Anti-FactorⅧ。
　　 結(jié)論:通過全髓貼壁法可獲得數(shù)量

4、足夠的、均質(zhì)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；BMSCs在L-DMEM(20％FBS+10ng/ml VEGF)誘導(dǎo)條件下可以定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞,通過此法可在體外獲得大量高純度的內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 目的:建立可以在體外穩(wěn)定地獲得大量高純度平滑肌細(xì)胞的簡便方法,并對(duì)獲得細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察及表面標(biāo)志鑒定。
　　 材料和方法:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P3-BMSCs在L-DMEM(20％FBS+2ng/ml:PDGF-BB)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)14d；對(duì)照組P3-

5、BMSCs以未加特殊誘導(dǎo)劑的L-DMEM+10％FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)14d；每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,培養(yǎng)7d和14d時(shí)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞爬片,分別用Anti-Actin alpha、Anti-Vimentin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。
　　 結(jié)果:P3-BMSCs經(jīng)L-DMEM(20％FBS+2ng/ml PDGF-BB)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞體積逐漸變大,呈不規(guī)則梭形,密集與稀疏相交錯(cuò),形成“峰一谷”狀形態(tài),而對(duì)照組仍為均一的

6、長梭形,漩渦狀、團(tuán)簇狀生長,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；分別應(yīng)用Anti-Actin alpha、Anti-Vimentin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測,結(jié)果顯示:7d和14d時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)Anti-Actin alpha的陽性率分別為78％和87％,而Anti-Vimentin表達(dá)為陰性；對(duì)照組細(xì)胞對(duì).Anti-Actin alpha和Anti-vimentin均呈陰性表達(dá)。
　　 結(jié)論:BMSCs在L-DMEM(20％FBS+2ng/ml

7、 PDGF-BB)誘導(dǎo)條件下可以定向分化為平滑肌細(xì)胞,通過此法可在體外獲得大量高純度的平滑肌細(xì)胞。
　　 目的:建立可以在體外穩(wěn)定地獲得大量高純度成纖維細(xì)胞的簡便方法,并對(duì)獲得細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察及表面標(biāo)志鑒定。
　　 材料和方法:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P3-BMSCs在L-DMEM(20％FBS+20ng/ml b-FGF)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)14d,對(duì)照組P3-BMSCs以未加特殊誘導(dǎo)劑的L-DMEM+10％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)14d；

8、每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,培養(yǎng)7d和14d時(shí)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞爬片,分別用Anti-Actin alpha.、Anti-Vimentin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。
　　 結(jié)果:P3-BMSCs經(jīng)L-DMEM(20％FBS+20ng/ml b-FGF)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞逐漸變得細(xì)長,紡錘形,呈束狀、網(wǎng)狀排列生長,而對(duì)照組仍為均一的長梭形,漩渦狀、團(tuán)簇狀生長,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；分別應(yīng)用Anti-Actin alpha、.An

9、ti-Vimentin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)7d和14d時(shí),細(xì)胞表達(dá)Anti-Actin alpha的陽性率分別為72％和82％,表達(dá)Anti-Vimentin的陽性率分別為75％和85％；而對(duì)照組細(xì)胞對(duì)Anti-Vimentin和對(duì)Anti-Actin alpha均呈陰性表達(dá)。
　　 結(jié)論:BMSCs在L-DMEM(20％FBS+20ng/ml b-FGF)誘導(dǎo)條件下可以定向分化為成纖維細(xì)胞,通過此