氟非尼酮對腎纖維化氧化應激反應的作用及機制研究.pdf

1、第一章氟非尼酮對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化及脂質(zhì)過氧化損傷的影響
　　目的:觀察氟非尼酮（AKF-PD）對UUO大鼠腎纖維化的療效及腎臟組織脂質(zhì)過氧化損傷的影響，探討AKF-PD抗腎纖維化的作用機制。
　　方法:建立單側輸尿管結扎(UUO)腎間質(zhì)纖維化模型。SD雄性大鼠（28只）隨機分為假手術組、UUO模型組、AKF-PD治療組及氯沙坦治療組，每組7只，于UUO術后14天留取各組大鼠梗阻側腎臟標本:分別行HE、MASSON及Ⅰ、

2、Ⅲ型膠原免疫組織化學染色，Western blot檢測纖維連接蛋白(FN)以觀察大鼠腎纖維化成模情況及藥物療效;提取腎組織勻漿總蛋白以ELISA方法檢測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物8異前列腺素(8-iso-PGF2a)，TRASB方法檢測丙二醛(MDA)的表達水平。
　　結果:(1) HE和MASSON染色結果顯示UUO術后14天模型組大鼠腎組織可見明顯間質(zhì)纖維化病理改變，腎間質(zhì)損傷指數(shù)和腎間質(zhì)膠原相對面積評分較假手術組明顯上升，造模成功;與模

3、型組比較，AKF-PD治療組及氯沙坦治療組腎組織間質(zhì)纖維化程度減輕，腎間質(zhì)損傷指數(shù)和腎間質(zhì)膠原相對面積評分顯著下降(P＜0.05); AKF-PD組抑制UUO大鼠腎間質(zhì)損傷及Ⅲ型膠原的表達，較氯沙坦組更為顯著(P＜0.05)。
　　(2) UUO術后14天模型組腎組織中MDA及8-iso-PG2Fa產(chǎn)生明顯升高（P＜0.05），AKF-PD能有效減少UUO術后14天病變腎臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物8-iso-PG2Fa、MDA的表達(P＜0

4、.05);氯沙坦能有效抑制UUO術后14天病變腎臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物8-iso-PG2Fa的表達（P＜0.05），對MDA的表達無明顯影響（P＞0.05）。
　　結論:(1) AKF-PD有抗腎間質(zhì)纖維化的作用，其療效優(yōu)于氯沙坦。
　　(2) AKF-PD能下調(diào)病變腎臟組織8-iso-PG2Fa及MDA的表達，AKF-PD抗腎臟脂質(zhì)過氧化損傷可能是其抗腎間質(zhì)纖維化作用的重要機制之一。
　　第二章氟非尼酮對UUO大鼠腎臟NA

5、DPH氧化酶及磷酸化Akt的影響
　　目的:觀察AKF-PD對UUO大鼠梗阻側腎組織中NADPH氧化酶及磷酸化Akt表達的影響。
　　方法:建立UUO模型。SD雄性大鼠（28只）隨機分為假手術組、UUO模型組、AKF-PD治療組及氯沙坦治療組，每組7只。于UUO術后14天留取各組大鼠梗阻側腎臟標本，提取總蛋白以Western blot檢測NADPH氧化酶Nox1、Nox2及磷酸化Akt蛋白表達水平;提取組織勻漿總蛋白以細胞色

6、素C法檢測NADPH氧化酶的活性。
　　結果:(1) UUO術后14天模型組腎組織中NADPH氧化酶及亞單位Nox1、Nox2產(chǎn)生較假手術組明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，AKF-PD及氯沙坦均能有效減少UUO術后14天病變腎臟NADPH氧化酶活性及Nox2的表達(P＜0.05);AKF-PD及氯沙坦對UUO術后14天病變腎臟Nox1的表達無明顯抑制作用(P＞0.05);兩種藥物對UUO大鼠腎組織中NADPH氧化酶的作用效

7、果相似。
　　(2) UUO術后14天模型組腎組織中磷酸化Akt表達水平較假手術組明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，AKF-PD及氯沙坦均能有效抑制UUO術后14天病變腎臟磷酸化Akt的表達(P＜0.05)。
　　結論:(1) AKF-PD能抑制UUO大鼠病變腎臟組織中NADPH氧化酶的表達，有效減輕病變腎臟的氧化應激損傷。
　　(2) AKF-PD能下調(diào)病變腎臟組織中磷酸化Akt的表達，提示AKF-PD抗氧化應

8、激的作用可能與PI3K/Akt信號通路有關。
　　第三章 AKF-PD對AngⅡ誘導NRK-52E細胞內(nèi)氧化應激反應及磷酸化Akt、ERK的影響
　　目的:觀察AKF-PD對AngⅡ誘導大鼠腎小管上皮(NRK-52E)細胞內(nèi)氧化應激反應及磷酸化Akt、ERK的影響，進一步探討AKF-PD抗氧化應激反應的作用機制。
　　方法:以大鼠腎小管上皮細胞株(NRK-52E)為研究對象，實驗分為正常對照組、AKF-PD組、Losa

9、rtan組及NADPH氧化酶抑制劑DPI組。分別給予AKF-PD、氯沙坦和NADPH氧化酶抑制劑DPI預處理后再加入血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激60min，運用DCFH-DA作為熒光探針，采用熒光酶標儀檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平;采用Western blot方法檢測NADPH氧化酶亞單位Nox1、Nox2及Collagen1a1蛋白質(zhì)的表達。應用AKF-PD、氯沙坦、PI3K抑制劑LY29004及MEK抑制劑U0126預處理NRK

10、-52E細胞后加入AngⅡ刺激15min收集細胞總蛋白，采用Western blot方法檢測細胞中磷酸化ERK及Akt的表達。
　　結果:(1) AngⅡ刺激腎小管上皮細胞60min后ROS產(chǎn)生較對照組顯著增高(P＜0.01);與模型組(AngⅡ)比較，AKF-PD、氯沙坦及NADPH氧化酶抑制劑DPI組均能抑制ROS的產(chǎn)生(P＜0.05)。
　　(2) AngⅡ刺激腎小管上皮細胞24小時后NADPH氧化酶Nox1、Nox2

11、及Collagen1a1蛋白質(zhì)表達較對照組顯著增高(P＜0.01);AKF-PD、氯沙坦及NADPH氧化酶抑制劑DPI均能降低NADPH氧化酶Nox2蛋白及Collagen1a1的表達(P＜0.05)，但對Nox1蛋白的表達無明顯抑制作用(P＞0.05)。
　　(3) AngⅡ刺激腎小管上皮細胞15min后磷酸化ERK及Akt水平較對照組明顯上升(P＜0.05);與模型組(AngⅡ)比較，AKF-PD、氯沙坦及LY29004、U0

12、126組均能抑制磷酸化Akt及ERK的表達(P＜0.01)。
　　結論:(1) AKF-PD能抑制AngⅡ誘導腎小管上皮細胞內(nèi)ROS及NADPH氧化酶的產(chǎn)生，有效減輕腎小管上皮細胞的氧化應激反應。
　　(2)AKF-PD能下調(diào)AngⅡ誘導腎小管上皮細胞磷酸化Akt及ERK的表達，其在抗腎纖維化及氧化應激反應時，能減少PI3K/Akt及MEK/ERK信號通路的傳導。
　　第四章 AKF-PD對氧化應激反應中PI3K/Ak

13、t及MEK/ERK信號通路的影響
　　目的:觀察AKF-PD對MEK1Q56P及PI3K P110α-CAAX高表達的NRK-52E細胞纖維化及氧化應激反應的影響，深入探討AKF-PD抗腎纖維化氧化應激反應的作用機制。
　　方法:(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構建PI3K P110α-CAAX過表達細胞株。實驗分為pbabe組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組）、PI3K組（轉(zhuǎn)染P110α-CAAX質(zhì)粒），PI3K+AKF-PD組（轉(zhuǎn)染P110α-CAAX質(zhì)粒

14、+AKF-PD8×10-3mol/L）;分別用流式細胞儀檢測NRK-52E細胞內(nèi)ROS的水平;提取細胞總蛋白，采用Western blot檢測NRK-52E細胞NADPH氧化酶、Col1 a1及磷酸化Akt蛋白表達水平。
　　(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構建MEK1Q56P過表達細胞株。，實驗分為pbabe組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組）、MEK組（轉(zhuǎn)染MEK1Q56P質(zhì)粒），MEK+AKF-PD組（轉(zhuǎn)染MEK1Q56P質(zhì)粒+AKF-PD8×10-3mol/

15、L）;分別用流式細胞儀檢測NREK-52E細胞內(nèi)ROS的水平;提取細胞總蛋白，采用Westernblot檢測NRK-52E細胞NADPH氧化酶、Col1 a1及磷酸化ERK蛋白表達水平。
　　結果:(1) NRK-52E細胞高表達PI3K P110α-CAAX后，細胞內(nèi)ROS、Col1 a1、NADPH氧化酶p47phox及Nox2表達較對照組顯著增高(P＜0.05)，AKF-PD干預組能減少ROS、Col1 a1、p47phox

16、的表達(p＜0.05)，但對Nox2無抑制作用(p＞0.05)。
　　(2) NRK-52E細胞高表達MEK1Q56P后，細胞內(nèi)ROS、Col1 a1及NADPH氧化酶Nox2蛋白的表達與對照組比較均明顯升高(p＜0.05)，AKF-PD干預組能抑制ROS、Nox2及Col1 a1的表達(P＜0.05)。
　　結論:(1) AKF-PD通過PI3K/Akt信號通路減少磷酸化Akt及NADPH氧化酶p47phox的表達，從而減