細胞因子緩釋微球聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療缺血性心臟病療效評價及MRI在體示蹤的實驗研究.pdf

1、目的：制備血管內(nèi)皮生長因子明膠微球并評價其緩釋性能。 方法：以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球。20％的明膠溶液滴加于橄欖油中攪拌至形成乳濁液，丙酮固化，異丙醇懸浮后以不同孔徑篩網(wǎng)篩分。離心干燥后，戊二醛交聯(lián)，清洗后冷凍干燥，得淡黃色明膠微球。鈷60照射滅菌。將微球浸泡于磷酸鹽緩沖液中24小時，微球充分溶脹后，以顯微鏡自帶軟件測量微球粒徑。取滅菌凍干明膠微球9mg，平均分成3組，將1.5μCi125I—VEGF溶于30μlPB

2、S中，平均滴加于3組明膠微球，4℃過夜。PBS離心洗滌2次。將微球重懸于2mlPBS中，于r—計數(shù)器檢測總放射性強度。之后將重懸的微球置于37℃恒溫搖床中，每24h全量更換溶出液。以r—計數(shù)器檢測各時點微球中的剩余放射性強度，繪制釋放曲線。昆明小鼠42只，隨機分為14組，每組3只。取明膠微球凍干粉126mg，平均分為42份，將21μCi125I—VEGF溶于420μlPBS中，平均滴加于每份明膠微球，4℃過夜。將每份微球重懸于100μl

3、PBS中，注射于小鼠左后肢皮下組織中。每24h處死一組小鼠，剪取左下肢，以r—計數(shù)器檢測組織中的剩余放射性強度。以每組放射性強度的平均值繪制125I—VEGF釋放曲線。 結(jié)論：明膠微球包載VEGF后能夠?qū)崿F(xiàn)VEGF的緩慢釋放。 目的：探討血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)緩釋明膠微球能否誘導缺血心肌血管新生。 方法：以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微

4、球，并以1，1’—雙十八烷—3，3，3’，3’—四甲基—吲哚—羧花青—高氯酸鹽(Dil)熒光標記。中華小型豬18頭，按照隨機化表將動物分為VEGF緩釋微球移植組、空載微球移植組及對照組。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心梗模型。心肌梗死模型建立后14d磁共振檢查后行二次開胸，暴露左室前壁近心尖部，于VEGF緩釋微球移植組動物梗死周邊區(qū)心肌注射包載VEGF的緩釋微球，每只動物注射3點，每點注射量3mg(含VEGF3μg)；于空載微球組梗

5、死周邊區(qū)心肌注射等量未包裹VEGF的緩釋微球，每只動物注射3個點。對照組注射含等量VEGF的磷酸鹽緩沖液。微球移植后24h(基線)及21d(終點)，電影MRI和增強MRI采集動物心功能參數(shù)并測量心梗面積。終點指標檢測結(jié)束后處死動物進行組織學檢測，免疫組化法檢測微球移植局部缺血心肌的纖維化程度、毛細血管密度及微球降解情況。 結(jié)論: 血管內(nèi)皮生長因子緩釋明膠微球能夠誘導缺血心肌區(qū)新生血管形成。 目的: 本研究通過觀察血管內(nèi)皮

6、生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)緩釋明膠微球與自體骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)聯(lián)合移植于豬心肌梗死模型梗死周邊區(qū)3周后MSCs的生存情況，結(jié)合磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，闡明改善局部微環(huán)境對自體MSCs移植于缺血心肌后轉(zhuǎn)歸的影響。 方法: 以乳化冷凝法制備VEGF緩釋明膠微球。中

7、華小型豬18頭。抽取髂骨骨髓并制備自體MSCs，以注射用順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide particles，SPIO)、4’，6—二脒基-2-苯基吲哚(4’，6—Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)標記細胞并進行標記率檢測。按照隨機化表將動物分為對照組、MSCs移植組(MSCs組)及MSCs—VEGF緩釋微球聯(lián)合移植組(MSCs—VEGF

8、組)。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心肌梗死模型。模型建立后第14天，磁共振延遲增強成像(delated enhancement MRI，DE—MRI)檢測梗死面積后行二次開胸，直視經(jīng)心外膜于MSCs組動物心肌梗死周邊區(qū)注射MSCs3個點(3×107/點)，于MSCs—VEGF緩釋微球組每只動物注射3個點，每點注射MSCs3×107及VEGF緩釋明膠微球3mg(含人重組VEGF1653μg)，于對照組動物心梗周邊區(qū)相應部位注射培養(yǎng)基

9、DMEM。微球移植后24h(基線)及21d(終點)，電影MRI和增強MRI采集動物心功能參數(shù)包括射血分數(shù)、左室舒張末期容積、左室收縮末期容積、左室前壁室壁增厚率，并測量心梗面積。終點指標檢測結(jié)束后處死動物進行組織學檢測，免疫組化法檢測微球移植局部缺血心肌的纖維化程度、毛細血管密度及干細胞存活情況。 結(jié)論: VEGF緩釋明膠微球可以提高移植于缺血心肌區(qū)3周MSCs的生存率。移植干細胞所生存的微環(huán)境是影響其轉(zhuǎn)歸的重要因素。

10、目的: 通過觀察移植于豬心肌梗死模型梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)順磁性氧化鐵顆粒標記的自體骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)所形成低信號區(qū)的信號變化情況，結(jié)合組織學檢查結(jié)果，評價MRI對干細胞移植于缺血心肌后數(shù)量演變的監(jiān)測價值。 方法: 中華小型豬6頭，抽取髂骨骨髓并制備自體骨髓間質(zhì)干細胞，以注射用順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide particles，S

11、PIO)和4’，6—二脒基-2-苯基吲哚(4’，6—Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)標記細胞并進行標記率檢測。開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備小型豬心肌梗死模型。模型建立后14d，行二次開胸，直視經(jīng)心外膜于每只動物心肌梗死周邊區(qū)和正常心肌區(qū)各注射標記MSCs2個點，每點注射MSCs3×107。同時分別于各區(qū)注射培養(yǎng)基2個點作為對照點。細胞移植后24h及21d，快速梯度回波序列(FG

12、RE序列)T2+像檢測干細胞移植點低信號區(qū)的面積及信號強度。T2*信號減低區(qū)范圍的測量由FGRE面積法實現(xiàn)，其信號減低的程度以正常心肌區(qū)和該區(qū)的T2*值之差與正常心肌區(qū)T2*值的百分比表示。病理組織學檢查心肌細胞形態(tài)、瘢痕形成、毛細血管密度及干細胞存活情況。不同時點MSCs注射點低信號區(qū)面積及T2*信號強度的比較采用重復測量方差分析及配對t檢驗。干細胞注射點與對照點毛細血管密度的比較、梗死周邊區(qū)及正常心肌區(qū)MSCs注射點信號衰減幅度的比

13、較采用成組資料t檢驗。 結(jié)論: MRI可在一定時間內(nèi)實現(xiàn)對移植干細胞的示蹤并反映移植MSCs在心肌局部的數(shù)量變化趨勢。移植干細胞所生存的微環(huán)境是影響其生存時間的重要因素。 目的: 本研究從細胞學實驗的角度探討在間充質(zhì)干細胞分裂增殖過程中標記于干細胞胞漿中的超順磁性氧化鐵顆粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)標記率的演變，以明確干細胞分裂增殖對SPIO標記率變化的影響。 方法:

14、抽取豬髂骨骨髓，密度梯度離心后獲取單個核細胞層，以差時貼壁的方法純化培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)。第一代細胞達到80％融合時，以1：3比例接種于兩組六孔板中。以含有10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)。在細胞達60-70％融合時，換以含鐵25ng/L及多聚賴氨酸375pg/L的培養(yǎng)基為細胞換液，并培養(yǎng)細胞48h。之后，細胞達到80％融合。將另一六孔板中的細胞以1：3比例傳代至新的3塊六孔板中，其中兩塊板的六個孔底部放置滅菌蓋玻片。其中一