骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對家兔股骨頭缺血性壞死的治療作用.pdf

1、股骨頭缺血性壞死(ANFH)是一種常見的骨關(guān)節(jié)疾病。有些研究認(rèn)為，ANFH可能是一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)減少性疾病；已有研究報道顯示，運(yùn)用自體紅骨髓移植治療ANFH，取得了一定的療效。但是，尚缺乏利用培養(yǎng)的BMSCs移植，對ANFH治療作用的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。BMSCs具有高度增殖和多向分化潛能，經(jīng)定向誘導(dǎo)可分化為骨、軟骨、脂肪、肌、肌腱、神經(jīng)細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)就BMSCs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，及其移植對ANFH的治

2、療作用，進(jìn)行觀察和分析：旨在探討B(tài)MSCs移植，對ANFH的治療作用、修復(fù)機(jī)理以及合理的治療方法。 一、BMSCs向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及其形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 目的：BMSCs具有高度增殖和多向分化潛能；目前，已成為骨組織工程技術(shù)中最為重要的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對BMSCs的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞的方向分化，利用光鏡和電鏡，觀察其細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 方法：從成年新西蘭大耳白兔髂后上嵴處抽取骨髓，種植于6孔細(xì)

3、胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液為含20％胎牛血清DMEM液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，傳代密度為1×106/cm2。第3代細(xì)胞培養(yǎng)，部分加入誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)劑為10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，10-8mmol/L地塞米松，50mg/L維牛素C。培養(yǎng)2周后，誘導(dǎo)和未加誘導(dǎo)的BMSCs，分別進(jìn)行堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和鈣化結(jié)節(jié)檢測，并用光鏡、掃描和透射電鏡，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果：全骨髓培養(yǎng)后，BMSCs呈放射狀克隆集落貼壁生長。通過消化

4、傳代后，細(xì)胞呈長梭形分散排列，少量細(xì)胞呈星形，胞漿豐富，常有1～2個細(xì)胞核，位置居中。堿性磷酸酶呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，鈣化結(jié)節(jié)和BMP免疫組織化學(xué)染色均呈陰性反應(yīng)。經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞生長旺盛，形體飽滿，體積逐漸增大，呈魚群樣排列。堿性磷酸酶、鈣化結(jié)節(jié)和BMP免疫組織化學(xué)均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。掃描電鏡觀察顯示，BMSCs呈長梭形，大部分細(xì)胞為單核。經(jīng)過向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)后，胞體增大，細(xì)胞呈現(xiàn)雙核增多現(xiàn)象。透射電鏡觀察顯示，BMSCs間無明顯連接結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核不

5、規(guī)則。經(jīng)過誘導(dǎo)后的細(xì)胞，細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙連接，細(xì)胞器更為豐富，并出現(xiàn)大量的基質(zhì)小泡、髓樣結(jié)構(gòu)和空泡狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核常呈圓形或橢圓形。 結(jié)論：BMSCs可通過全骨髓培養(yǎng)、細(xì)胞貼壁生長篩選法，存體外進(jìn)行大量擴(kuò)增；在體外可通過定向誘導(dǎo)，向成骨細(xì)胞分化。BMSCs在體外經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞間出現(xiàn)典型的縫隙連接，細(xì)胞器更為豐富，并出現(xiàn)大量的基質(zhì)小泡、髓樣結(jié)構(gòu)和空泡狀結(jié)構(gòu)，這些變化可能是誘導(dǎo)后成骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征。 二、BMSCs移植

6、對實(shí)驗(yàn)性家兔ANFH的治療作用 目的：ANFH可能有多種發(fā)病機(jī)制；近年來有些研究認(rèn)為，ANFH可能是一種BMSCs減少性疾病。本實(shí)驗(yàn)采用體外擴(kuò)增的BMSCs移植，治療實(shí)驗(yàn)性家兔ANFH，旨在探討其治療作用和修復(fù)機(jī)制。 方法：48只成年新西蘭大白兔，隨機(jī)分成A、B、C、D四組，每組12只。A組為單純造模組，B組為髓芯減壓組，C組為自體BMSCs移植組，D組為同種異體BMSCs移植組。全部采用液氮冷凍股骨頭負(fù)重區(qū)的方法，制作

7、ANFH的實(shí)驗(yàn)動物模型。四組實(shí)驗(yàn)動物，分別于術(shù)后2、4、6、8周，各處死3只動物，進(jìn)行股骨頭標(biāo)本的大體解剖學(xué)觀察、X-線檢查以及組織學(xué)觀察。 結(jié)果：采用液氮冷凍法，成功制備了ANFH的動物模型，所有標(biāo)本在組織學(xué)上，表現(xiàn)出骨壞死與修復(fù)過程。在X-線上，呈現(xiàn)股骨頭密度增高、骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂和軟骨下囊性變，個別標(biāo)本還出現(xiàn)了塌陷現(xiàn)象和類似骨性關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn)。B組標(biāo)本在2周時，鉆孔區(qū)邊緣出現(xiàn)較多的成骨細(xì)胞，并有新骨形成，鉆孔的中央部空虛，至8

8、周時鉆孔中央形成骨髓組織。在X-線上，術(shù)后2周時鉆孔缺損區(qū)邊緣密度有所增高，中心密度減低；8周時鉆孔區(qū)中心仍呈低密度，而邊緣密度增高，并形成硬化線。在C、D兩組的股骨頭標(biāo)本，其鉆孔區(qū)組織學(xué)變化大致相似。術(shù)后2周時，鉆孔缺損區(qū)內(nèi)有大量的成骨細(xì)胞，只有D組的缺損區(qū)內(nèi)，常見一些漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。4周時鉆孔區(qū)內(nèi)有大量骨小梁形成及類骨質(zhì)填充。8周時鉆孔區(qū)內(nèi)骨小梁更趨成熟，小梁問有骨髓組織填充。在X-線上，C、D兩組標(biāo)本于術(shù)后4周時，整個鉆孔區(qū)密度

9、均增高，8周時出現(xiàn)正常的骨小梁結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：液氮冷凍法是制備ANFH家兔模型的良好方法；形成ANFH后，由于BMSCs數(shù)目減少，導(dǎo)致修復(fù)能力下降，單純髓芯減壓術(shù)療效有限；髓芯減壓術(shù)聯(lián)合BMSCs移植，對ANFH有著較好的治療作用，修復(fù)機(jī)制主要以膜內(nèi)化骨方式為豐；采用同種異體BMSCs移植修復(fù)ANFH，雖在早期出現(xiàn)了輕度的免疫反應(yīng)，但其最終的修復(fù)效果，與自體BMSCs移植無明顯差異。 三、BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后移植對實(shí)

10、驗(yàn)性家兔ANFH的治療作用 目的：通過BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后移植，是否能更早更好的形成骨組織，目前尚缺乏相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)采用誘導(dǎo)和未加誘導(dǎo)的BMSCs，移植治療家兔ANFH，旨在探討兩種移植方式的優(yōu)劣性。 方法：成年新西蘭大耳白兔24只，隨機(jī)分為A、B兩組，每組12只。A組為BMSCs移植組，B組為向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的BMSCs移植組。每組的實(shí)驗(yàn)動物，分別于術(shù)后2、4、6、8周，各處死3只動物，進(jìn)行股骨頭標(biāo)本X.

11、線檢查、組織學(xué)觀察、圖象分析以及免疫組織化學(xué)檢測。同時將誘導(dǎo)后1、2、3周的第3代細(xì)胞爬片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果：BMSCs經(jīng)過向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化2周后，BMP免疫組織化學(xué)染色觀察顯示，有部分細(xì)胞呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；兩組股骨頭標(biāo)本術(shù)后2周時，BMP免疫組織化學(xué)染色表明，幾乎全部細(xì)胞呈現(xiàn)陽性表達(dá)。兩組標(biāo)本的X-線變化基本一致。隨著時間的進(jìn)展，缺損區(qū)密度逐漸增高，6周時出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)，8周時缺損區(qū)呈現(xiàn)正常的骨小梁結(jié)構(gòu)。兩組標(biāo)本的組

12、織學(xué)變化也大致相似。術(shù)后2周時，鉆孔缺損區(qū)內(nèi)有大量的成骨細(xì)胞。4周時缺損區(qū)內(nèi)有大量骨小梁形成及類骨質(zhì)填充。在8周時缺損區(qū)內(nèi)骨小梁趨于成熟，并有大量骨髓組織形成。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析表明，兩組缺損區(qū)骨小梁的面積百分比值，起差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化和未加誘導(dǎo)的BMSCs，對于移植治療ANFH的作用基本相同，其修復(fù)過程也大體相似；股骨頭局部的內(nèi)環(huán)境，對于BMSCs的成骨誘導(dǎo)作用，強(qiáng)于體外誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)作用。 四、不

13、同密度BMSCs移植對實(shí)驗(yàn)性家兔ANFIt的治療作用 目的：采用BMSCs移植方法修復(fù)骨缺損時，往往需要考慮兩個方面的問題：一是充足的BMSCs數(shù)目，二是合適的干細(xì)胞移植密度。本試驗(yàn)采用髓芯減壓術(shù)聯(lián)合不同密度的BMSCs移植，對ANFH的治療作用進(jìn)行了觀察和分析，旨在探索合適的BMSCs移植密度，為臨床提供依據(jù)。 方法：成年新西蘭大耳白兔40只，隨機(jī)分為A、B、C、D、E兩組，每組8只。A組為104密度級別BMSCs移植

14、組，B組為105密度級別組，C組為106密度級別組，D組為107密度級別組，E組為108密度級別組。每組實(shí)驗(yàn)動物，分別于術(shù)后2周處死1只、4、6周各處死2只， 8周處死3只，進(jìn)行股骨頭標(biāo)本X-線檢查、組織學(xué)觀察、圖象分析。 結(jié)果：A組實(shí)驗(yàn)動物的股骨頭標(biāo)本X-線變化，在術(shù)后2周時，鉆孔缺損區(qū)邊緣密度有所增加，缺損區(qū)中心密度較低。4周時缺損區(qū)密度有不均勻增高。6周時缺損區(qū)有模糊的骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，部分區(qū)域呈現(xiàn)低密度。8周時部分區(qū)域有清

15、晰的骨小梁結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域呈低密度腔隙。B、C、D、E組實(shí)驗(yàn)動物的股骨頭標(biāo)本，其X-線變化基本一致。隨著時間的進(jìn)展，缺損區(qū)密度逐漸增高，6周出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)，8周時缺損區(qū)呈現(xiàn)正常的骨小梁結(jié)構(gòu)。在組織學(xué)上，A組實(shí)驗(yàn)動物的股骨頭標(biāo)本術(shù)后2周時，鉆孔邊緣形成較多新生骨組織，新生骨內(nèi)側(cè)有一個成骨細(xì)胞聚集層，而鉆孔區(qū)中心充滿了炎癥細(xì)胞。 4周時，鉆空區(qū)新生骨小梁增多，但并不在全部區(qū)域，部分標(biāo)本在鉆孔中央形成少量骨組織，部分標(biāo)本無骨組織形成。8周時鉆孔

16、邊緣區(qū)充滿分布不均勻的骨小梁組織和骨髓組織。 B、C、D、E組實(shí)驗(yàn)動物的股骨頭標(biāo)本，其組織學(xué)變化也大致相似。術(shù)后2周時，鉆孔缺損區(qū)內(nèi)有大量的成骨細(xì)胞。4周時缺損區(qū)內(nèi)有大量骨小梁形成及類骨質(zhì)填充。在8周時缺損區(qū)內(nèi)骨小梁趨于成熟，并有大量骨髓組織形成。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析表明，兩組缺損區(qū)骨小梁的面積百分比值，無顯著性差異。 結(jié)論：利用BMSCs移植治療骨缺損的數(shù)學(xué)模型，存在一定的局限性；105-108密度級別的BMSCs移植，修復(fù)ANFH

17、呈現(xiàn)相似的結(jié)果；提示在采用培養(yǎng)的BMSCs移植修復(fù)ANFH時，不宜采用104以下的密度級別，應(yīng)該盡可能提高移植細(xì)胞的密度。 五、自體松質(zhì)骨聯(lián)合BMSCs移植對實(shí)驗(yàn)性家兔ANFH的治療作用 目的：采用自體松質(zhì)骨移植，是治療ANFH的常用方法之一，其臨床失敗率，可能與BMSCs的數(shù)量減少，修復(fù)過程不活躍有關(guān)。本試驗(yàn)旨在探討聯(lián)合應(yīng)用BMSCs，在自體松質(zhì)骨移植治療ANFH方面的作用。 方法：24只成年新西蘭大耳白兔，隨