血府逐瘀湯逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的作用機制研究.pdf

1、研究背景：
　　高血壓是世界上常見的危害人類健康的疾病，是誘導中風、心肌梗死、血管疾病及慢性腎臟疾病的主要因素之一。高血壓是心肌纖維化病變的主要因素，可導致病理學特征的心肌損害。高血壓引起心臟壓力負荷持續(xù)增加，引發(fā)間質(zhì)和血管周圍膠原纖維的過度增生和異常積累，最終導致心肌纖維化。心肌纖維化是慢性心臟病的一個重要組成部分，被越來越多地認為在慢性心臟病的病程進展中起重要作用。因此，預防和治療心肌纖維化具有巨大的臨床價值和社會意義。目前認

2、為，心肌纖維化是多種常見的心臟疾病向終末期心臟病發(fā)展的一個必然過程，是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的一個關鍵時期。心肌纖維化是決定心血管疾病預后的一個關鍵性的因素，形成的機制非常復雜，涉及多種細胞因子。其中研究較多的是轉(zhuǎn)化生長因子β，它被公認是器官纖維化的治療靶標。
　　TGF-β是擁有眾多細胞因子成員的大家族，研究較多的是其中重要的TGF-βs。在哺乳動物中只發(fā)現(xiàn)了TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3這3種形式。其中TGF-

3、β1主要有由成纖維細胞產(chǎn)生，在心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中，TGF-β1發(fā)揮促肌性成纖維細胞的轉(zhuǎn)化、促膠原基因表達、促細胞外基質(zhì)合成等作用，是最重要的促心肌纖維化的細胞因子之一。種種研究表明，病理性TGF-β1的增加在心肌纖維化的增殖和變異中起著關鍵的作用，抗TGF-β1的治療無疑將成為心肌纖維化防治的重要策略。近年來針對TGF-β1在心肌纖維化領域的治療研究已取得進展，但是其臨床療效有待進一步確認。
　　Smads為TGF-β信

4、號通路中的下游轉(zhuǎn)導蛋白，它可以將TGF-β信號由細胞膜表面直接傳送到細胞核內(nèi)。TGF-β作為配體，與受體相結(jié)合后，激活Smads蛋白轉(zhuǎn)導進入核內(nèi)，共同調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。哺乳動物中的Smads蛋白至少有8種，按結(jié)構(gòu)和功能可分為3個亞型:(1)受體激活型Smads，包括了Smad1、2、3、5和8。(2)共同介質(zhì)Smads，在哺乳動物中為Smad4。(3)抑制型Smads，包括了Smad6、7。TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導通路中各種類型Sm

5、ads分子之間作用精密協(xié)調(diào)，共同完成了生理以及病理狀態(tài)下TGF-β的生物學效應。
　　傳統(tǒng)中醫(yī)多采用中藥復方對患者進行治療。當前許多中醫(yī)療法的療效被證實是由多種因素介導的。這些藥方中的藥理活性成分許多已被探明，其中部分被報道對多種疾病有顯著的療效，例如腫瘤、炎癥、心血管疾病等。
　　高血壓心肌纖維化屬于中醫(yī)理論中“心悸”、“喘證”、“水腫”等范疇。血府逐淤湯是由桃紅四物湯改進而來，由十一味中藥組成，近年來臨床上廣泛用于高血壓

6、心臟病的治療。許多中醫(yī)學相關文獻報道服用中藥方劑血府逐淤湯對治療高血壓相關癥狀諸如頭痛頭暈等療效顯著，然而這些復方的潛在作用機制和治療效果尚不清楚。
　　研究目的：
　　本課題以自發(fā)高血壓大鼠為實驗對象，不同劑量血府逐淤湯予以灌胃給藥，觀測藥物對自發(fā)高血壓大鼠心肌纖維化的影響。檢測心肌組織中TGF-β1及Smad2、3、7蛋白的表達情況，初步探究血府逐淤湯逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用機制。為臨床使用血府逐淤湯治療心肌纖維化提供實驗依

7、據(jù)。
　　研究方法：
　　1.25只SHR大鼠隨機分為5個實驗組，每組5只，此外另設5只WKY大鼠為陰性對照組，共六組:(1) WKY對照組;(2) SHR對照組;(3) SHR+6g·kg-1血府逐淤湯組;(4) SHR+12g·kg-1血府逐淤湯組;(5) SHR+18g·kg-1血府逐淤湯組;(6) SHR+60mg·kg-1卡托普利組。各組大鼠均灌胃給藥，WKY對照組和SHR對照組分別給予等量蒸餾水。每日上午10點整

8、給藥一次，連續(xù)給藥16周。
　　2.大鼠尾動脈壓測量儀檢測給藥前后尾動脈收縮壓，探究藥物對SHR血壓的影響。
　　3.將大鼠麻醉處死，采集心肌組織并做相應處理，為后續(xù)相關實驗提供實驗樣本。
　　4.樣本堿水解法檢測心肌組織羥脯氨酸含量，估算心肌膠原蛋白含量。
　　5.心肌組織的固定及石蠟切片標本的制作。
　　6.Masson三色膠原染色進行心肌組織病理學檢測，計算膠原蛋白容積分數(shù)。
　　7.免疫組化法

9、觀測心肌組織中TGF-β1蛋白的分布及表達。
　　8.熒光實時定量PCR檢測心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達。
　　9.Western blot法檢測心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達。
　　研究結(jié)果：
　　1.藥物對大鼠血壓的影響
　　SHR大鼠血壓顯著高于WKY大鼠，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01);灌胃給藥后卡托普利組大鼠血壓顯著降低，有

10、統(tǒng)計學差異（P＜0.05），而其余各組血壓變化不明顯。
　　2.心肌組織羥脯氨酸含量測定
　　羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)其成色深淺可推算膠原含量。SHR對照組大鼠心肌組織羥脯氨酸含量顯著高于WKY對照組，有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）;卡托普利及高劑量血府逐淤湯組相對于SHR對照組羥脯氨酸含量顯著降低(P＜0.001);中劑量血府逐淤湯組也能明顯降低羥脯氨酸含量(P＜0.05

11、);而低劑量血府逐淤湯組對羥脯氨酸影響不明顯，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　3.MASSON三色膠原染色檢測心肌組織纖維化程度
　　經(jīng)MASSON染色后，心肌膠原纖維呈現(xiàn)藍色，心肌肌纖維呈現(xiàn)紅色，胞漿呈藍黑色。使用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測量并分析膠原面積，計算膠原蛋白容積分數(shù)(CVF)。SHR對照組CVF值顯著高于WKY對照組，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);卡托普利組相對于SHR對照組CVF值顯

12、著降低（P＜0.01）;高劑量血府逐淤湯組CVF值也能明顯降低（P＜0.05）;而低劑量及中劑量血府逐淤湯組CVF值相比SHR對照組差別不明顯，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4.免疫組化法檢測心肌組織中TGF-β1蛋白表達
　　使用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)分析，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表現(xiàn)，分別測出陽性反應細胞的累計光密度值(IOD)和分布面積(Area)，計算出平均光密度值(Density)

13、，反映TGF-β1蛋白相對含量。SHR對照組TGF-β1蛋白含量顯著高于WKY對照組，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);卡托普利及高劑量血府逐淤湯組相對于SHR對照組TGF-β1蛋白含量顯著降低(P＜0.05);而低劑量及中劑量血府逐淤湯組TGF-β1蛋白含量相比SHR對照組差別不明顯，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　5.熒光實時定量PCR檢測心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達
　　Rea

14、l Time PCR反應結(jié)束后確認擴增曲線、融解曲線及Ct值，使用2-△△Ct法計算各目標基因的相對起始模板溶度。SHR對照組對比于WKY對照組，TGF-β1、Smad2、3的mRNA表達明顯升高，Smad7的mRNA表達含量明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05);卡托普利組對比于SHR對照組，TGF-β1、Smad2、3的mRNA表達明顯降低，Smad7的mRNA表達含量明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.05);高劑量血府逐淤湯組對

15、比于SHR對照組，TGF-β1、Smad2的mRNA表達明顯降低，Smad7的mRNA表達含量明顯升高，具有顯著性差異（P＜0.05），但Smad3的mRNA表達變化不明顯，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);低劑量及中劑量血府逐淤湯組對比于SHR對照組TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達均無顯著差異(P＞0.05)。
　　6.Western blot法檢測心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad

16、7蛋白表達
　　膠片進行掃描，用Image-pro Plus6.0圖像分析軟件分析目標條帶的光密度值，觀測各蛋白含量表達。SHR對照組對比于WKY對照組，TGF-β1、Smad2、3蛋白含量明顯升高，Smad7蛋白含量明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05);卡托普利組對比于SHR對照組，TGF-β1、Smad2、3蛋白含量明顯降低，Smad7蛋白含量明顯升高，具有顯著性差異（P＜0.05）;高劑量血府逐淤湯組對比于SHR對照組，

17、TGF-β1、Smad2蛋白含量明顯降低，Smad7蛋白含量明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.05)，但Smad3含量變化不明顯，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);低劑量及中劑量血府逐淤湯組對比于SHR對照組TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白含量表達均無顯著差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　(1)血壓大鼠相比于wistar大鼠，收縮壓升高，心肌膠原蛋白含量增加，心肌組織中能觀察到顯著的纖維化病變，與相