心肌再灌注損傷中NECA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響.pdf

1、目的：本課題主要研究ERS及其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否參與了腺苷受體激動劑NECA的心臟保護作用并初步探討其可能的機制。
　　方法：本實驗首先選取清潔級Wistar大鼠56只，分為正常對照組（Control組）、缺血/再灌注組（I/R組）、NECA組及TUDCA組四個組，利用心臟Langendorff灌流裝置制備大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型，使用RM6240BD型多道生理信號采集系統(tǒng)監(jiān)測并記錄穩(wěn)定期、缺血期及再灌注過程中心率、左心室

2、發(fā)展壓等血流動力學(xué)參數(shù)并測定該過程中的冠脈流量，從而反映心臟功能的變化。其次，用免疫印跡（Western blot）法檢測ERS伴侶蛋白GRP94及其致細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性分子CHOP的蛋白表達情況。另外，用TUNEL法對心肌細(xì)胞的凋亡情況進行觀察；用透射電鏡觀察心臟超微結(jié)構(gòu)的變化；HE染色觀察心臟病理組織學(xué)的變化情況。
　　結(jié)果：1多道生理記錄儀采集結(jié)果顯示：離體大鼠心臟缺血及再灌注時，冠狀動脈流量（coronary flow, C

3、F）、心率（heart rate, HR）及左室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure, LVDP）明顯下降（P<0.05），舒張末壓（end diastolic pressure, EDP）顯著升高（P<0.05）。而再灌注時給予NECA（100nmol/L），可以明顯增加冠狀動脈流量、心率及左室發(fā)展壓（P<0.05），且能使舒張末壓顯著降低（P<0.05）。提示NECA能夠改善再灌注時心臟的功

4、能。2用Western blot方法檢測離體大鼠心臟再灌注時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子GRP94的蛋白表達情況，結(jié)果顯示，與Sham組相比，再灌注時，I/R組GRP94的表達顯著升高（P<0.05），提示心肌缺血/再灌注能夠誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。而再灌注前5min給予NECA后，GRP94的表達較I/R組明顯下降（P<0.05），此種變化趨勢與給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑TUDCA（30μmol/L）后的變化趨勢一致，說明NECA能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

5、從而對缺血/再灌注損傷的心臟產(chǎn)生保護作用。另外用Western blot方法檢測離體大鼠心臟再灌注時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的特異性轉(zhuǎn)錄因子CHOP的蛋白表達情況，結(jié)果顯示，與Sham組相比，再灌注時，I/R組CHOP的表達顯著升高（P<0.05），提示心肌缺血/再灌注時發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡。而再灌注前5min給予NECA后，CHOP的表達較I/R組明顯下降（P<0.05），此種變化趨勢與給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑TUDCA后的變化趨勢

6、一致，說明NECA能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡從而對缺血/再灌注損傷的心臟產(chǎn)生保護作用。且再灌注120min時，NECA組CHOP的表達低于TUDCA組（P<0.05），說明NECA抑制心肌缺血/再灌注引發(fā)的細(xì)胞凋亡可能并不只是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡這一通路完成的。3透射電鏡結(jié)果顯示，離體大鼠心臟再灌注30min時，Sham組心肌細(xì)胞線粒體沿肌絲長軸排列整齊，外膜完整，嵴密集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常；I/R組心肌細(xì)胞出現(xiàn)了廣泛的線

7、粒體損傷，線粒體排列紊亂，嵴消失，水腫，或成空泡樣變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯；而給予NECA或TUDCA后，線粒體損傷程度減輕，除部分線粒體有改變外，與對照組無明顯區(qū)別，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)基本正常，無明顯擴張。4 HE染色結(jié)果顯示：離體大鼠心臟再灌注30min時，Sham組心肌纖維排列整齊；I/R組心肌組織病理損傷嚴(yán)重，心肌纖維排列紊亂、斷裂，間質(zhì)充血、水腫；而給予 NECA或TUDCA后，心肌損傷程度減輕。再灌注120min時，I/R組心肌細(xì)胞壞死