RNA干擾HIF-1α基因?qū)︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的VEGF表達(dá)及其增殖的影響.pdf

1、目的：
　　研究常氧和缺氧培養(yǎng)條件下類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者成纖維樣滑膜細(xì)胞表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的差異性及相關(guān)性。同時(shí)探討 shRNA特異性干擾沉默缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）后對 RA成纖維樣滑膜細(xì)胞的VGEF表達(dá)及其增殖的影響。
　　方法：
　　1.運(yùn)用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng) RA患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞，同時(shí)分離培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞并設(shè)為

2、對照組。將兩組細(xì)胞分別置于常氧和缺氧條件下培養(yǎng)不同時(shí)間，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時(shí)間分為常氧組、缺氧6h組及缺氧12h組；采用免疫印跡法（Western blot）檢測各組滑膜細(xì)胞的HIF-1α及VEGF的表達(dá)情況并進(jìn)行相關(guān)分析。
　　2.將 RA患者滑膜細(xì)胞分為4組：常氧組、缺氧組、陰性質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒）和陽性質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染 HIF-1α陽性質(zhì)粒）。常氧組于常氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，后三組于缺氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)12h；采用免疫印跡法（W

3、estern blot）和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time PCR）法分別檢測各組滑膜細(xì)胞中HIF-1α及VEGF的蛋白和mRNA表達(dá)情況，并進(jìn)行相關(guān)性分析。將缺氧組、陰性質(zhì)粒組和陽性質(zhì)粒組的滑膜細(xì)胞分別于缺氧條件下培養(yǎng)6h、12h、24h及48h，應(yīng)用MTS法檢測缺氧對滑膜細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1.常氧組的RA與OA患者滑膜細(xì)胞HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)無明顯差異（P均＞0.05）；而缺氧6h及12

4、h組的RA和OA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞的HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)水平較常氧組均顯著升高（P均＜0.05）；且缺氧12h組的RA和OA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞的HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)又高于缺氧6h組（P均＜0.05）。RA患者滑膜細(xì)胞在缺氧6h及12h條件下的HIF-1α和 VEGF蛋白表達(dá)均高于同組的OA患者（P均＜0.05）。上述RA和OA患者滑膜細(xì)胞的HIF-1α與VEGF的表達(dá)均呈正相關(guān)（rRA=0.871；rOA=0.7

5、59，P均<0.05）。
　　2.缺氧組的RA滑膜細(xì)胞HIF-1α和VEGF蛋白及其mRNA表達(dá)水平較常氧組明顯升高（P均＜0.05）；陰性質(zhì)粒組和缺氧組的滑膜細(xì)胞HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA表達(dá)水平無明顯差異（P均＞0.05）；而陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的滑膜細(xì)胞 HIF-1α和 VEGF蛋白及mRNA與缺氧組相比表達(dá)有所下降（P均＜0.05）。上述RA滑膜細(xì)胞的HIF-1α與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.89，P＜0.01）

6、，且其HIF-1α與VEGF的mRNA表達(dá)也呈正相關(guān)（r=0.79，P＜0.01）。通過分析缺氧條件對 RA滑膜細(xì)胞增殖情況的影響發(fā)現(xiàn)，缺氧培養(yǎng)12h后陽性質(zhì)粒組的滑膜細(xì)胞生長較缺氧對照組和陰性質(zhì)粒組的滑膜細(xì)胞生長均減慢（P均＜0.05）；而后兩組滑膜細(xì)胞的生長無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在缺氧條件下，RA滑膜細(xì)胞的HIF-1α及 VEGF表達(dá)顯著升高且密切相關(guān)，推測“缺氧-HIF-1α-VEGF”這一