TWEAK誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞合成MMPs及其相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的自身免疫性疾病，其特征性病理改變表現(xiàn)為滑膜組織異常增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成，最終侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞。其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年研究證實(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)在RA關(guān)節(jié)骨及軟骨的破壞中發(fā)揮重要作用。腫瘤壞死因子樣凋亡的微弱誘導(dǎo)劑(tumor necr

2、osis factor-like weak inducer ofapoptosis，TWEAK)是腫瘤壞死因子(trumor necrosis factor，TNF)配體超家族的新成員，具有廣泛的生物學(xué)活性。作為一個(gè)多效性細(xì)胞因子，TWEAK在RA的發(fā)生、發(fā)展中所起的核心作用備受關(guān)注。本研究首先通過(guò)觀察TWEAK在不同濃度下對(duì)RA FLS誘導(dǎo)合成MMPs的影響，探討TWEAK參與RA關(guān)節(jié)骨及軟骨破壞的相關(guān)機(jī)制。
　　 TWEAK

3、是通過(guò)與其受體相互結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能的。TweakR/Fn14是與4種不同的TRAF家族成員相關(guān)聯(lián)的功能性TWEAK受體。研究發(fā)現(xiàn)TweakR/Fn14位于質(zhì)膜，是一種在細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中發(fā)揮作用的跨膜分子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究TWEAKR/Fn14在RA FLS的表達(dá)，以及影響TWEAKR/Fn14在RA FLS表達(dá)的因素，進(jìn)一步探討TWEAK發(fā)揮其生物學(xué)功能的具體機(jī)制。
　　 TWEAK與RA FLS表面相應(yīng)的受體結(jié)合以后，激

4、活特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路才能發(fā)揮其多種生物學(xué)效應(yīng)。p38蛋白激酶是控制炎癥反應(yīng)最主要的MAPK家族成員之一。p38激酶在RA發(fā)病中的作用日益受到人們的重視。目前，關(guān)于TWEAK處理后的RA FLS能夠激活哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，國(guó)內(nèi)外的研究尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)著重探討P38MAPK信號(hào)通路在TWEAK誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞合成MMPs過(guò)程中的作用，試圖揭示TWEAK誘導(dǎo)RA FLS活化及導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎性破壞的相關(guān)機(jī)制，為RA治療尋求新的靶點(diǎn)。<

5、br>　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下取得新鮮的RA滑膜組織，膠原酶消化法分離純化滑膜成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)用3～7代細(xì)胞。
　　 2、取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FLS，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入TWEAK、TNF-α、IL-1β、SB203580，于37℃5％CO2孵箱內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)72h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞置-20℃?zhèn)溆谩?br>　　 3、免疫組化法定位檢測(cè)TWEA

6、KR/Fn14蛋白在RA FLS的表達(dá)。
　　 4、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-1、MMP-3的濃度。
　　 5、RT-PCR法檢測(cè)MMP-1、MMP-3、Fn14基因mRNA的表達(dá)。
　　 6、、Western blotting法(免疫印跡法)測(cè)定TWEAKR/Fn14、p-p38MAPK和p65在RA FLS的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、TWEAK誘導(dǎo)RA FLS合成MMP-1、M

7、MP-3的水平高于對(duì)照組，呈明顯的劑量依賴性，TWEAK終濃度為50 ng/ml的實(shí)驗(yàn)組MMP-1、MMP-3刺激指數(shù)分別為3.233、3.218，TWEAK終濃度為100 ng/ml的實(shí)驗(yàn)組MMP-1、MMP-3刺激指數(shù)分別為5.906、6.119，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TNF-α和IL-1β對(duì)TWEAK誘導(dǎo)RA FLS合成MMP-1、MMP-3具有協(xié)同作用，相同TWEAK濃度下的實(shí)驗(yàn)組，單純TWEAK組與協(xié)同作用組比

8、較，協(xié)同作用組MMP-1、MMP-3的水平明顯高于單純TWEAK組，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TNF-α與IL-1β對(duì)TWEAK誘導(dǎo)RAFLS合成MMP-1、MMP-3的協(xié)同作用，無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 2、TWEAK終濃度為100ng/ml誘導(dǎo)RA FLS的MMP-1、MMP-3mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.29、1.26倍，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TNF-α和IL

9、-1β對(duì)TWEAK誘導(dǎo)RA FLS的MMP-1、MMP-3mRNA表達(dá)具有協(xié)同作用，單純TWEAK組與協(xié)同作用組比較，協(xié)同作用組MMP-1、MMP-3mRNA表達(dá)水平明顯高于單純TWEAK組，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TNF-α與IL-1β對(duì)TWEAK誘導(dǎo)RA FLS MMP-1、MMP-3mRNA表達(dá)的協(xié)同作用，無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3、免疫組化染色顯示胞膜及胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀物質(zhì)的細(xì)胞為

10、TWEAKR/Fn14染色陽(yáng)性的細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組可見(jiàn)少量TWEAKR/Fn14染色陽(yáng)性的細(xì)胞；TWEAK(終濃度為100ng/ml)存在時(shí)TWEAKR/Fn14在RA FLS表達(dá)較對(duì)照組增多；TNF-α和IL-1β能夠顯著增強(qiáng)TWEAKR/Fn14在RA FLS的表達(dá)。
　　 4、TWEAK終濃度為100ng/ml的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組TWEAKR/Fn14蛋白表達(dá)為對(duì)照組1.199倍，F(xiàn)n14基因mRNA的表達(dá)為對(duì)

11、照組的1.273倍；TNF-α和IL-1β對(duì)TWEAK誘導(dǎo)RA FLS的TWEAKR/Fn14蛋白表達(dá)和Fn14基因mRNA的表達(dá)具有協(xié)同作用，單純TWEAK組與協(xié)同作用組比較，TNF-α和IL-1β協(xié)同作用組TWEAKR/Fn14蛋白表達(dá)分別為單純TWEAK組的2.239、2.359倍，F(xiàn)n14基因mRNA的表達(dá)分別為單純TWEAK組的1.705、1.738倍。
　　 5、終濃度為100ng/ml的TWEAK作用于RA FLS

12、，能夠使p38MAPK磷酸化，并使細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白表達(dá)增加。p-p38MAPK及p65蛋白表達(dá)量隨著TWEAK作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，TWEAK作用于RA FLS120min時(shí)，p-p38MAPK及p65蛋白表達(dá)趨于高峰，分別為空白對(duì)照組的4.615、3.415倍。
　　 6、SB203580能夠部分抑制終濃度為100ng/ml的TWEAK誘導(dǎo)RA FLS合成的MMPs和MMPs mRNA的表達(dá)，陽(yáng)性對(duì)照組TWEAK誘導(dǎo)RA F

13、LS合成MMP-1、MMP-3的刺激指數(shù)分別為1μmol/L SB203580組的2.106、1.806倍，為10μmol/L SB203580組的3.021、2.417倍，與陽(yáng)性對(duì)照組比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組TWEAK誘導(dǎo)RA FLS表達(dá)MMP-1、MMP-3mRNA分別為1μmol/L SB203580組的1.339、1.394倍，為10μmol/L SB203580組的1.419、1.424倍，與陽(yáng)性對(duì)照組

14、比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、TWEAK通過(guò)誘導(dǎo)RA FLS合成MMP-1、MMP-3，直接損傷關(guān)節(jié)骨和軟骨，參與RA的發(fā)生發(fā)展。
　　 2、TNF-α和IL-1β在TWEAK誘導(dǎo)RA FLS合成MMP-1、MMP-3的過(guò)程中，發(fā)揮協(xié)同作用，從而與TWEAK共同參與RA關(guān)節(jié)骨和軟骨的破壞。
　　 3、RA FLS的質(zhì)膜存在TWEAKR/Fn14表達(dá)，在重組TWEAK存在時(shí)

15、TWEAKR/Fn14表達(dá)增加。
　　 4、TNF-α和IL-1β通過(guò)增加RA FLS的TWEAKR/Fn14表達(dá)，發(fā)揮對(duì)TWEAK生物學(xué)活性的協(xié)同作用。
　　 5、TWEAK誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞合成MMPs過(guò)程中，p38MAPK信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，并誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮TWEAK的生物學(xué)活性。
　　 6、p38MAPK活化的抑制劑SB203580能夠顯著抑制RA FLS MMP-1、MM