慢病毒介導(dǎo)的PDE4DmiRNA對(duì)抑郁癥和認(rèn)知損傷的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)博士學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)的PDE4DmiRNA對(duì)抑郁癥和認(rèn)知損傷的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究RoleofLentivirus—mediatedPDE4DmiRNAonDepressionandCognitiveImpairement課題來(lái)源：國(guó)家自然科學(xué)基金一廣東省聯(lián)合基金專業(yè)名稱學(xué)位申請(qǐng)人指導(dǎo)教師答辯委員會(huì)藥理學(xué)張聰徐江平張漢霆主席余細(xì)勇教授答辯委員會(huì)成員論文評(píng)閱人劉培慶教授黎明濤教授臧林泉教授李國(guó)鋒教授年月日廣州中文摘

2、要AB42誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷模型中小鼠認(rèn)知行為的調(diào)節(jié)作用及其對(duì)cAMP信號(hào)通路和促炎因子的影響。該研究為進(jìn)‘步闡明長(zhǎng)鏈PDE4D在抑郁癥和認(rèn)知障礙疾病中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法：(1)首先構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生PDE4D4miRNA的重組質(zhì)粒，與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生高滴度慢病毒。體外感染培養(yǎng)的293T細(xì)胞檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。采用腦立體定位技術(shù)在小鼠海馬DG區(qū)微量注射慢病毒介導(dǎo)的PDE4DmiRNA引起目的基因表達(dá)沉默，14天后取

3、海馬組織檢測(cè)PDE4DmiRNA對(duì)PDE4A／B／D以及PDE4D3／4／5的mRNA水平的影響。(2)采用慢性不可預(yù)知性溫和刺激使小鼠接受應(yīng)激67天，誘導(dǎo)產(chǎn)生小鼠抑郁樣癥狀，糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠抑郁程度。抑郁模型建立后，采用腦立體定位技術(shù)在小鼠海馬DG區(qū)微量注射慢病毒，14天后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，懸尾實(shí)驗(yàn)和糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)小鼠抑郁狀態(tài)；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)小鼠的焦慮狀態(tài)；高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)小鼠海馬中cAMP水

4、平；PcR技術(shù)和westcmBlot技術(shù)分別檢測(cè)了小鼠海馬cAMPPKA—cREB通路的變化。(3)采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。小鼠雙側(cè)海馬DG區(qū)注射老化的Ap42(05肛g／side)誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，24小時(shí)后注射慢病毒在同一位點(diǎn)，14天后采用水迷宮和新物體識(shí)別用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)小鼠海馬中cAMP水平；PcR技術(shù)和WestemBlot技術(shù)分別檢測(cè)了

5、小鼠海馬cAMPPKA—cREB通路以及炎癥因子的變化。研究結(jié)果：(1)慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。無(wú)論攜帶陰性對(duì)照還是PDE4D基因序列的慢病毒均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果。而且，PDE4DmiRNA能顯著降低PDE4D，PDE4D4和PDE4D5的表達(dá)水平，而對(duì)PDE4A／B和PDE4D3的表達(dá)沒(méi)有顯著性影響。(2)在小鼠經(jīng)歷慢性不可預(yù)知性溫和刺激過(guò)程中，應(yīng)激小鼠