Il-13對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、目的:
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)簡稱類風(fēng)濕，是一種病因復(fù)雜且無特異性診斷指標(biāo)的慢性、自身系統(tǒng)性免疫炎性疾病，累及多關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)外器官，嚴(yán)重影響患者的身心健康及生活質(zhì)量。目前，仍缺乏具有特異療效且副作用小的治療藥物，因此，探索效果顯著、無副作用或副作用較小的天然活性成分已成為研究RA藥物的熱點。白介素13(Interleukin-13，IL-13)是一種天然的抗炎性細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)

2、效應(yīng)。結(jié)合IL-13具有的免疫刺激和免疫抑制共存的生物學(xué)活性，其已成為多種過敏及免疫性疾病在臨床研究和治療中的一個重要靶點;同時IL-13也具有較強的抗炎效應(yīng)，可抑制一系列由TNF-α引起的疾病病情的進程。因此，IL-13有望成為治療RA的一種天然活性成分。本課題通過建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，研究抗炎性細(xì)胞因子IL-13對其的作用，并對其作用機制進行初步研究。
　　方法:
　　1.采用弗式完全佐劑建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型，并利用分

3、析天平測量實驗大鼠體重，使用足趾容積測量儀測定大鼠的足趾容積，采用評分法（0～4分）對實驗大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)進行評價，進一步通過增重率、足趾腫脹程度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)及脾臟指數(shù)對AA大鼠進行評價;
　　2.通過增重率、足趾腫脹程度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)及脾臟指數(shù)初步檢測IL-13對AA大鼠的作用，并進一步應(yīng)用ELISA法測定AA大鼠血漿炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度;3.應(yīng)用脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)誘

4、導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立體外炎癥細(xì)胞模型，以研究IL-13抗關(guān)節(jié)炎的作用機制，應(yīng)用MTT法測定IL-13對LPS模型組細(xì)胞增殖作用的藥效曲線，ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度，Western blotting檢測MAPK和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化程度。
　　結(jié)果:
　　1.佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立與評價:與對照組大鼠相比，右后足趾皮內(nèi)注射CFA的模型組大鼠自14d起，增重率

5、明顯下降，且隨時間延長，與對照組的差異逐漸增大，在第30d達(dá)到最大，此時的增重率為54.98％，而對照組大鼠的增重率已達(dá)94.87％;在造模14d時模型組大鼠出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)炎癥狀，即大鼠對側(cè)腳及尾根出現(xiàn)腫脹、爪子表面有紅斑，足趾的腫脹率達(dá)到65.73％，與空白對照組有顯著差異(P＜0.01)。22 d左右達(dá)到高峰，此時模型大鼠行動不便，表現(xiàn)為對側(cè)及前足腫脹，耳和尾根出現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)炎結(jié)節(jié)，骨骼也明顯變形、間隙變大;與對照組大鼠相比，模型組大

6、鼠的脾臟明顯增生。以上結(jié)果表明本實驗利用CFA成功建立了AA大鼠模型，可用于進一步的實驗研究。
　　2.IL-13對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的作用:與AA模型大鼠相比，低、中、高劑量的IL-13均能提高大鼠的增重率;中、高劑量的IL-13能顯著(P＜0.05)降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，在致炎第30 d時，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)為3.25，而中、高劑量IL-13組分別降至1.31、1.21;低、中、高劑量的IL-13均可降低AA大鼠的足趾腫脹率，且隨時

7、間延長，IL-13中、高劑量組可顯著降低大鼠的足趾腫脹率，在致炎第30d時，模型組大鼠足趾腫脹率為65.85％，中、高劑量組已降至56.75％、54.26％;重組IL-13各劑量組均可不同程度降低造模大鼠的脾指數(shù)，中、高劑量組與模型組相比，脾指數(shù)顯著降低(P＜0.05，P＜0.01); ELISA結(jié)果顯示，中、高劑量IL-13組大鼠血清中IL-1β(74.35 pg/mL、63.75 pg/mL)、TNF-α(223.76pg/mL19

8、0.45 pg/mL)和IL-6(106.85 pg/mL、92.86 pg/mL)的含量均極顯著地低于模型組的(**P＜0.01)。因此，本研究認(rèn)為IL-13能在一定程度上減輕AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀并恢復(fù)部分免疫功能，可能與IL-13降低血清中炎性因子L-1β、TNF-α和IL-6的含量相關(guān)。
　　3.IL-13對AA大鼠模型作用的機制研究:LPS刺激可導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞內(nèi)IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白含量顯著上升(P

9、＜0.05)，且引起MAPK和NF-κB信號通路活化。當(dāng)終濃度為2、10、50μM的IL-13存在的情況下，均可顯著地降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清液中的IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白含量(P＜0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性地降低;10μM和50μM的IL-13可明顯抑制致炎RAW264.7細(xì)胞中P38和ERK的磷酸化程度，對JNK的磷酸化程度基本無影響，而50μM的阿司匹林對P38和ERK的磷酸化都無明顯影響;2μM、1

10、0μM和50μM的IL-13處理致炎的RAW264.7細(xì)胞后，IκB、P65的磷酸化程度明顯降低，而50μM的阿司匹林卻不能抑制IκB、P65的磷酸化。因此，IL-13可明顯降低致炎細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的分泌，抑制致炎細(xì)胞中MAPK和NF-κB信號通路的活化，這可能是IL-13抗炎效應(yīng)的機制，亦即IL-13抑制AA病理過程和恢復(fù)病情的一種機制。
　　結(jié)論:
　　本實驗利用CFA成功建立了具備典型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的的AA大鼠模

11、型，并證明IL-13能在一定程度上改善AA模型大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，降低血清中炎癥因子的濃度，控制關(guān)節(jié)炎病情的進展;體外細(xì)胞實驗表明，IL-13可明顯降低炎性細(xì)胞因子的含量，抑制MAPK和NF-κB信號通路的活化，提示IL-13具有較強的抗炎效應(yīng)，這可能是IL-13抑制AA病理進程的一種機制。
　　意義:
　　1.研究了IL-13對AA大鼠的抗關(guān)節(jié)炎作用;
　　2.研究了IL-13抗關(guān)節(jié)炎作用的機制;
　　3.為類風(fēng)