肝癌治療潛在靶點c-Met及腫瘤靶向治療效果及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目標(biāo)：
　　 肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在中國，由于存在較為嚴(yán)重的乙型肝炎病毒(HBV)感染等致癌風(fēng)險因素，肝癌的發(fā)病率和死亡率態(tài)勢尤為嚴(yán)峻。肝癌的治療手段主要包括肝移植、腫瘤切除及非切除性局部療法如肝動脈化療栓塞等。由于肝癌特別是肝細(xì)胞肝癌(HCC)早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移以及治療后易復(fù)發(fā)，系統(tǒng)化療是臨床上亟需的HCC治療手段。靶向于酪氨酸激酶受體(recepto

2、r tyrosine kinase，RTK)的索拉菲尼(Sorafinib)是近年來在美國等多個國家批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的第一個對HCC有效的系統(tǒng)化療藥物，是HCC分子靶向治療研究進(jìn)程中的一座里程碑。c-Met是RTK家族的典型成員之一，是當(dāng)前抗腫瘤分子靶向藥物研制的一個重要的靶點。然而，由于c-Met信號通路在HCC病理學(xué)狀態(tài)下有諸多不明之處，以c-Met為靶點的抗HCC藥物的研究與開發(fā)較為遲緩。我們課題組前期有關(guān)脫-γ-羧基凝血酶原(de

3、s-γ-carboxy prothrombin，DCP)的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)DCP能夠激活c-Met信號傳導(dǎo)通路，對HCC細(xì)胞增殖和侵襲具有促進(jìn)作用，可能在人HCC的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用。在此基礎(chǔ)上對HCC病理狀態(tài)下c-Met信號通路傳導(dǎo)機(jī)制的重新審視和進(jìn)一步研究，將有助于更好地理解HCC的發(fā)病機(jī)制并推動抗HCC分子靶向藥物研究與開發(fā)的進(jìn)程。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN/CD13)在

4、促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用，是當(dāng)前抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移藥物研究中的重要靶酶之一。腫瘤細(xì)胞早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移以及由此導(dǎo)致的治療后易復(fù)發(fā)是HCC最為顯著的特點，因此控制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移在HCC的治療中具有十分重要的意義。既往的研究表明，HCC細(xì)胞株APN/CD13表達(dá)水平較高，可能與其易發(fā)生轉(zhuǎn)移的行為有關(guān)。因此APN/CD13抑制劑可能具有較好地控制HCC侵襲和轉(zhuǎn)移的效果。肝臟是人體最大的實質(zhì)性臟器，血供豐富，被認(rèn)為是體內(nèi)僅次于淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)

5、移癌好發(fā)部位。卵巢癌肝轉(zhuǎn)移后形成的繼發(fā)性肝癌是臨床常見的轉(zhuǎn)移癌類型。當(dāng)肝轉(zhuǎn)移灶為多發(fā)性同時化療又不敏感時，治療將非常困難。因此，尋找新型的有效的卵巢癌治療藥物具有重要的意義。研究表明，APN/CD13在卵巢癌細(xì)胞有較高水平的表達(dá)，是抗卵巢癌藥物研發(fā)的靶點之一。因此本課題的另一個目標(biāo)是研究APN/CD13抑制劑抗HCC侵襲和轉(zhuǎn)移的效果以及探討該類抑制劑對易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的卵巢癌的抗腫瘤效果和機(jī)制。
　　 第一章 HCC病理狀態(tài)下DCP

6、/c-Met的表達(dá)及臨床意義
　　 第一節(jié).DCP在HCC組織中的表達(dá)特征和血清中的含量及其臨床意義
　　 目的：測定DCP在人HCC組織中的表達(dá)特征和在血清中的含量并分析其與HCC臨床病理學(xué)因素的關(guān)系，探討DCP在人HCC演進(jìn)過程中的促進(jìn)作用。
　　 方法：選取92例行手術(shù)切除治療的單發(fā)性HCC患者，收集并統(tǒng)計患者臨床病理學(xué)因素包括年齡、性別、背景肝組織病毒感染和肝硬化狀況、腫瘤病程進(jìn)展、腫瘤分化程度、腫瘤體積

7、、血管侵襲狀況和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移狀況等。免疫組化法測定腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織中DCP的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)測定患者血清中DCP的含量。采用x2檢驗分別分析腫瘤組織中DCP的表達(dá)和血清中DCP含量與臨床病理學(xué)因素的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法計算術(shù)后患者的生存率，并以log-rank檢驗比較DCP血清含量高/低兩組患者五年生存率的差異。以Cox風(fēng)險回歸模型分析影響患者術(shù)后生存的因素。
　　 結(jié)果：免疫組化研究

8、結(jié)果顯示73.9％的患者HCC組織中DCP的表達(dá)呈陽性。DCP在腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤的生長方式有關(guān)，浸潤性生長或無包膜的腫瘤中DCP表達(dá)的陽性率顯著高于膨脹性生長或有包膜的腫瘤，提示DCP的存在可能加重了腫瘤的惡性程度，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞向周圍非腫瘤組織的侵襲。ELISA檢測結(jié)果顯示44.6％的患者血清DCP的含量高于HCC診斷截斷值0.0625 AU/ml。HBsAg陽性、腫瘤中等分化程度、腫瘤存在血管侵襲和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤病程處于Ⅲ/Ⅳ

9、期或腫瘤體積大于50 mm時，患者血清中往往含有超過截斷值的高水平的DCP含量?；颊哐錎CP的含量與術(shù)后生存期有關(guān)，血清中含有高水平DCP的患者五年生存率顯著低于血清中含有低水平DCP的患者。
　　 結(jié)論：DCP在HCC患者血清和腫瘤組織中普遍存在，與多種病理學(xué)因素相關(guān)。DCP的表達(dá)與腫瘤具有較高的惡性程度相關(guān)。結(jié)合我們課題組前期有關(guān)DCP促進(jìn)HCC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的實驗結(jié)果，已有的證據(jù)提示DCP在HCC的演進(jìn)中可能發(fā)揮了重要

10、的促進(jìn)作用。
　　 第二節(jié).HCC組織中DEP與c-Met共表達(dá)及臨床意義
　　 目的：探討DCP和c-Met在人HCC組織中表達(dá)是否具有一致性及其臨床意義
　　 方法：選取153例行手術(shù)切除治療的單發(fā)性HCC患者，收集并統(tǒng)計患者臨床病理學(xué)因素包括年齡、性別和術(shù)后HCC復(fù)發(fā)狀況。免疫組化法分別測定腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織中DCP和c-Met表達(dá)狀況。采用x2檢驗分析組織中DCP和c-Met存在的相關(guān)性以及DCP/

11、c-Met表達(dá)與HCC復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　 結(jié)果：DCP在腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織中的陽性表達(dá)率分別為63.4％(97/153)和13.1％(20/154)，c-Met在腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織中的陽性表達(dá)率分別為66.7％(102/153)和28.8％(44/153)。DCP和c-Met在腫瘤組織中的陽性表達(dá)率均顯著高于其在癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)率。在腫瘤組織中，51％(78/153)的病例DCP和c-Met表達(dá)同時為陽性，20

12、.9％(32/153)的病例二者的表達(dá)同時為陰性。在非腫瘤組織中，7.2％(11/153)的病例DCP和c-Met表達(dá)同時為陽性，65.4％(100/153)的病例二者的表達(dá)同時為陰性。在整個組織標(biāo)本中，58.2％(89/153)的病例DCP和c-Met表達(dá)同時為陽性，19.6％(30/153)的病例二者的表達(dá)同時為陰性。x2檢驗表明DCP和c-Met在HCC標(biāo)本中的存在具有相關(guān)性。c-Met在腫瘤組織中的表達(dá)與術(shù)后HCC復(fù)發(fā)有關(guān)。c-

13、Met結(jié)合DCP比c-Met單獨對預(yù)測術(shù)后HCC復(fù)發(fā)的意義更顯著。c-Met和DCP在HCC標(biāo)本中的表達(dá)均為陰性時，該組病人術(shù)后復(fù)發(fā)率低于c-Met或DCP表達(dá)為陰性的各組患者的復(fù)發(fā)率。
　　 結(jié)論：c-Met和DCP在HCC組織中的表達(dá)具有廣泛性和一致性，與HCC術(shù)后高復(fù)發(fā)率有關(guān)。當(dāng)二者表達(dá)均為陰性時，HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較低。
　　 第二章 c-Met抑制劑抗HCC效果及機(jī)制研究
　　 目的：探討c-Met激

14、酶小分子抑制劑SU11274對HCC細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 方法：選用高分化型HCC細(xì)胞株HepG2和HuH-7及低分化型HCC細(xì)胞株HLE，MTT法分別測定：①DCP對三種細(xì)胞增殖的刺激作用；②c-Met激酶抑制劑SU11274對三種細(xì)胞增殖的抑制作用；③同時加入DCP和SU11274對三種細(xì)胞增殖的影響。Western blot法測定SU11274對HepG2、HuH-7和HLE細(xì)胞c-Met、磷酸化c-Met和磷酸化E

15、RK水平的影響。
　　 結(jié)果：c-Met激酶特異性小分子抑制劑SU11274具有抑制HCC細(xì)胞生長增殖的活性。其對分化性高的細(xì)胞株HepG2和。HuH7以及分化性低的細(xì)胞株HLE增殖的半數(shù)抑制濃度類似，均在6-9μM范圍內(nèi)。DCP對肝癌細(xì)胞株的增殖有不同程度的刺激作用。SU11274能夠抑制或抵消DCP促進(jìn)HCC細(xì)胞生長增殖的生物學(xué)作用。SU11274能夠降低細(xì)胞磷酸化c-Met、磷酸化ERK的水平，從而抑制c-Met信號通路的

16、傳導(dǎo)。
　　 結(jié)論：c-Met激酶小分子抑制劑SU11274能夠顯著地抑制HCC細(xì)胞生長增殖，并能對抗或抵消DCP促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖的作用。抑制c-Met激酶活性可能是抗HCC藥物研究與開發(fā)的合理策略，該類抑制劑可能對表達(dá)DCP的HCC更有效。
　　 第三章 APN/CD13抑制劑抗腫瘤效果及機(jī)制研究
　　 第一節(jié).APN/CD13抑制劑抗HCC侵襲及新血管生成研究
　　 目的：探討APN/CD13抑制劑

17、24F對HCC細(xì)胞侵襲和新血管生成的抑制作用
　　 方法：選用人HCC細(xì)胞HuH-7和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，二者均表達(dá)APN/CD13。以L-亮氨酸對硝基苯胺為底物測定24F對APN/CD13酶活性的抑制作用。MTT法測定24F對HuH-7細(xì)胞增殖的抑制作用。Transwell細(xì)胞侵襲實驗測定24F對HuH-7細(xì)胞侵襲和游走運動能力的抑制作用。微管形成實驗測定24F對HUVEC細(xì)胞在Matrigel表面形成微管樣結(jié)構(gòu)的

18、抑制作用。
　　 結(jié)果：化合物24F對APN/CD13酶活性的半數(shù)抑制濃度為1.88 mM。24F在0-200μg/mL濃度范圍內(nèi)對HuH-7細(xì)胞的增殖具有輕微地抑制作用，未觀察到該化合物對HuH-7有明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)。體外細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果表明，24F能夠減少穿過Matrigel的HuH-7細(xì)胞數(shù)目，顯示其對腫瘤細(xì)胞侵襲和游走運動能力的抑制作用。24F能夠在體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC形成微管樣結(jié)構(gòu)，提示24F具有潛在的抑制腫

19、瘤新血管生成的能力。
　　 結(jié)論：APN/CD13抑制劑24F對HCC細(xì)胞侵襲和游走運動能力具有抑制作用，對血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC微管形成具有抑制作用，提示APN/CD13抑制劑在抗HCC侵襲轉(zhuǎn)移及新血管生成方面具有潛在的應(yīng)用價值。
　　 第二節(jié).APN/CD13抑制劑抗卵巢癌增殖及新血管生成研究
　　 目的：探討APN/CD13抑制劑LYP對卵巢癌生長增殖及新血管生成的抑制作用。
　　 方法：體外實驗選

20、用人卵巢癌細(xì)胞株ES-2和SKOV-3以及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC。三種細(xì)胞均表達(dá)APN/CD13，表達(dá)水平由高到低依次為ES2、SKOV-3和HUVEC。MTT實驗測定LYP對細(xì)胞增殖的抑制作用。臺盼藍(lán)實驗檢測LYP的細(xì)胞毒效應(yīng)。以L-亮氨酸對硝基苯胺為底物測定LYP對APN/CD13酶活性的抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實驗分別測定LYP對細(xì)胞APN/CD13表達(dá)水平的影響。劃痕實驗和Transwell侵襲實驗

21、觀察LYP對HUVEC細(xì)胞侵襲和游走運動能力的抑制作用。微管形成實驗測定LYP對HUVEC細(xì)胞在Matrigel表面形成微管結(jié)構(gòu)的抑制作用。裸鼠接種ES-2細(xì)胞后尾靜脈給予LYP治療兩周，觀察藥物對ES-2腫瘤生長的抑制作用和裸鼠對給藥方案的耐受性。CD34免疫組化實驗測定LYP對ES-2腫瘤組織平均血管密度和平均血管直徑的影響。Western blot實驗測定LYP對腫瘤組織內(nèi)APN/CD13、VEGF、bFGF和TGFα表達(dá)水平的影

22、響。
　　 結(jié)果：MTT實驗結(jié)果表明LYP能夠有效的抑制ES-2細(xì)胞的增殖。LYP對ES-2細(xì)胞APN/CD13酶的活性具有顯著的抑制作用。相同濃度下，LYP對APN/CD13酶活性的抑制作用大于烏苯美司。相對于ES-2細(xì)胞，LYP對SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用較弱，提示LYP對ES-2細(xì)胞增殖的抑制作用可能與抑制APN/CD13有關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)實驗和Western blot實驗表明LYP能夠降低體外培養(yǎng)ES-2細(xì)胞APN/C

23、D13的表達(dá)水平。裸鼠接種ES-2細(xì)胞后尾靜脈給予LYP，連續(xù)治療兩周，ES-2腫瘤的生長受到顯著的抑制作用。Western blot實驗結(jié)果顯示LYP能夠降低腫瘤組織APN/CD13的含量。與陽性對照藥烏苯美司相比，LYP對ES-2腫瘤生長的抑制作用較強。裸鼠對給藥方案的耐受性良好，給藥組裸鼠的體重與陰性對照組比較沒有顯著性差異。
　　 為進(jìn)一步研究LYP抑制體內(nèi)ES-2腫瘤生長作用背后的機(jī)制，我們檢測了LYP在抑制新血管生成

24、方面的藥理活性。MTT實驗和臺盼藍(lán)實驗結(jié)果顯示在5-80μM濃度范圍內(nèi)，LYP對HUVEC細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)。在該濃度范圍內(nèi)LYP對HUVEC細(xì)胞APN/CD13酶的活性有一定的抑制作用。Transwell侵襲實驗和劃痕實驗結(jié)果顯示LYP能夠明顯抑制HUVEC細(xì)胞的侵襲和游走運動能力。微管形成實驗表明LYP對HUVEC細(xì)胞在Matrigel表面形成微管樣結(jié)構(gòu)具有抑制作用。LYP對新血管生成的抑制作用在體內(nèi)實驗中得到了驗證。對ES-

25、2腫瘤組織進(jìn)行CD34免疫染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LYP給藥組腫瘤平均血管密度和平均血管直徑均小于陰性對照組。在相同給藥劑量下，LYP抑制新血管生成的作用大于陽性對照藥烏苯美司。LYP的抗微血管生成作用可能與其抑制與血管生成有關(guān)的分子的表達(dá)有關(guān)。Western blot實驗結(jié)果顯示，LYP給藥組腫瘤組織內(nèi)VEGF、bFGF和TGF-α的水平顯著低于陰性對照組。
　　 結(jié)論：LYP在體外和體內(nèi)對卵巢癌細(xì)胞生長增殖具有較強的抑制作用，該作用可