馬黛多酚對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 馬黛對(duì)血脂異常亞健康人群的干預(yù)機(jī)制研究
　　目的：
　　觀察馬黛對(duì)血脂升高人群的血脂水平、血黏度、微循環(huán)等相關(guān)指標(biāo)的影響。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象及方法
　　從2012年11月～2013年12月在山東中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院體檢人群中篩選LDL-C、TC指標(biāo)升高，且甲襞微循環(huán)圖形異常的志愿者進(jìn)行研究。142位高血脂患者按照1∶1的比例隨機(jī)分為馬黛組和安慰劑組。經(jīng)過

2、六周的干預(yù)治療，比較服用馬黛及安慰劑治療前后的各項(xiàng)檢測指標(biāo)。
　　2.血液標(biāo)本的采集；
　　3.血脂檢測；
　　4.甲襞微循環(huán)檢測；
　　5.血液流變學(xué)檢測；
　　6.血清6-keto-PGF1α和TXB2的檢測；
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用paired t-test檢驗(yàn);多組間比較采用LSD分析。P＜0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)有顯著差異

3、。
　　結(jié)果：
　　1.血脂結(jié)果分析
　　經(jīng)過六周的馬黛及安慰劑干預(yù)，治療后馬黛組的HDL-C水平比治療前升高，而TC、LDL-C、TG水平比治療前下降，安慰劑組血脂水平?jīng)]有顯著變化。馬黛組血脂水平接近正常健康對(duì)照組。
　　2.甲襞微循環(huán)結(jié)果分析
　　經(jīng)過六周的馬黛及安慰劑干預(yù)，治療后馬黛組的甲襞微循環(huán)的輸入枝管徑、輸出枝管徑、輸出/輸入枝管徑、袢頂直徑以及甲襞微循環(huán)形態(tài)積分比治療前顯著的下降，微循環(huán)血液流

4、速比治療前顯著升高。
　　3.血流變結(jié)果分析
　　經(jīng)過干預(yù)，治療后馬黛組的全血高切粘度、全血中切粘度、全血低切粘度、血漿粘度、血沉方程K值比治療前顯著下降。
　　4.血清TXB2、6-keto-PGF1α結(jié)果分析
　　經(jīng)過干預(yù)，治療后馬黛組的TXB2比治療前顯著下降，6-keto-PGF1α水平顯著上升，接近健康人群。
　　結(jié)論：
　　1.馬黛可以調(diào)節(jié)血脂異常人群的血脂水平，顯著降低的TC、TG、LD

5、L-C水平，升高HDL-C水平。
　　2.馬黛能夠調(diào)節(jié)血脂異常人群的甲襞微循環(huán)、血流變及TXB2、6-keto-PGF1α等各項(xiàng)指標(biāo)。
　　3.臨床研究證實(shí)每天服用馬黛能使高血脂、高黏血癥、血流異常的患者恢復(fù)正常，從而降低AS發(fā)生的危險(xiǎn)。
　　第二部分 馬黛多酚抑制OX-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究
　　一、馬黛多酚對(duì)泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積和炎性因子的影響
　　目的：
　　觀察馬黛多酚對(duì)動(dòng)脈粥樣

6、硬化巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成過程中的內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)、血脂代謝的作用。
　　方法：
　　1.馬黛多酚的制備:
　　取馬黛1000g，用70％乙醇，以10倍料液比，在80℃下回流提取60min，減壓濃縮回收乙醇，得到浸膏。
　　2.培養(yǎng)泡沫細(xì)胞
　　3.實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)分為五組，即OX-LDL組、OX-LDL+辛伐他汀、OX-LDL+MP低劑量、OX-LDL+MP中劑量、OX-LDL+MP高劑量。<

7、br>　　4.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測各實(shí)驗(yàn)組LOX-1mRNA、ACAT1 mRNA、PCSK9 mRNA、CD36 mRNA、SR-A mRNA的表達(dá)。
　　5.ELISA法檢測各實(shí)驗(yàn)組各組細(xì)胞表達(dá)水平。
　　6.Western blot檢測各實(shí)驗(yàn)組LOX-1、AKT、NF-κB、ERK1/2的蛋白質(zhì)表達(dá)及磷酸化改變。
　　結(jié)果：
　　1.建立THP-1單核巨噬細(xì)胞泡沫化模型

8、r>　　2.干預(yù)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞泡沫化
　　3.MP對(duì)清道夫受體的作用
　　結(jié)果表明經(jīng)辛伐他汀干預(yù)后，CD36、SR-A，LOX-1均顯著降低。而不同濃度的MP處理后，只有LOX-1顯著下降(P＜0.01)。CD36、SR-A雖然也有輕微的下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.MP對(duì)炎癥因子及黏附因子的作用
　　結(jié)果顯示辛伐他汀和MP干預(yù)可以顯著降低TNF-α、IL-6、L一1β、VCAM1水平
　

9、　5.MP對(duì)AKT、NF-kb、ERK1/2蛋白表達(dá)的影響
　　結(jié)果顯示辛伐他汀和MP干預(yù)可以顯著降低PAKT/AKT、PNF-kb/NF-kb、PERK1/2/NF-kb的比值。
　　6.MP對(duì)ACAT1的作用
　　結(jié)果顯示辛伐他汀和MP干預(yù)可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)ACAT1水平
　　結(jié)論：
　　1.不同濃度的馬黛多酚可抑制MFC形成。
　　2.馬黛多酚對(duì)清道夫受體、炎性因子、黏附分子和脂質(zhì)代謝均有調(diào)節(jié)作

10、用。
　　3.馬黛多酚可調(diào)節(jié)ERK1/2、AKT、NF-KB等信號(hào)通路，通過減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)達(dá)到抑制泡沫細(xì)胞形成。
　　二、構(gòu)建LOX-1基因慢病毒干擾載體探討MP對(duì)泡沫細(xì)胞脂質(zhì)代謝和炎癥因子的影響
　　目的：
　　構(gòu)建LOX-1基因的RNA干擾慢病毒載體，篩選最佳沉默點(diǎn)包裝病毒。研究LOX-1基因沉默表達(dá)后對(duì)OX-LDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)代謝及炎癥相關(guān)基因的影響。
　　方法：
　　1.構(gòu)

11、建LOX-1基因慢病毒干擾載體
　　2.實(shí)驗(yàn)分組
　　泡沫細(xì)胞分為5組:空載體組、辛伐他汀組、200ug/mlMP組、LOX-1干擾組、200ug/mlMP+ LOX-1干擾組
　　3.ELISA檢測LOX-1慢病毒干擾后OX-LDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、eNOS、ACAT表達(dá)水平
　　4.Western blot檢測LOX-1慢病毒干擾后OX-LDL誘導(dǎo)泡沫

12、細(xì)胞的LOX-1蛋白質(zhì)表達(dá)及NF-κB的蛋白質(zhì)表達(dá)及磷酸化改變
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建LOX-1基因慢病毒干擾載體
　　測序證實(shí)，靶向LOX-1RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功，Western Blotting結(jié)果3個(gè)RNAi組的LOX-1蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組明顯降低，其中LOX-1干擾位點(diǎn)2抑制效果最佳
　　2.LOX-1慢病毒干擾載體在誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞過程中對(duì)NF-kb的影響
　　通過West

13、ern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LOX-1基因沉默可導(dǎo)致NF-kb的活化，而聯(lián)合MP干預(yù)則能促進(jìn)NF-kb的活化。
　　3.ELISA結(jié)果顯示LOX-1基因慢病毒干擾載體可顯著降低TNF-α、VCAM-1、MCP-1、ACAT的表達(dá)，升高eNOS的表達(dá)。而聯(lián)合MP干預(yù)則能促進(jìn)這一效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)成功構(gòu)建靶向LOX-1RNAi慢病毒載體，并有效抑制LOX-1表達(dá)。
　　2.LOX-1基

14、因干擾可顯著降低了細(xì)胞的TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、ACAT1水平，升高了eNOS的水平，聯(lián)合馬黛多酚干預(yù)能增強(qiáng)這一效應(yīng)，阻止泡沫細(xì)胞的形成。
　　3.LOX-1基因沉默可抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而降低炎癥因子、黏附分子和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集。馬黛多酚可以通過干預(yù)LOX-1/NF-κB信號(hào)通路，而發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞泡沫化、抗AS的作用。
　　第三部分 馬黛多酚對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬

15、化斑塊的影響及其機(jī)制探討
　　目的：
　　觀察馬黛多酚對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)的作用，探討馬黛多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的部分作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　6周齡雄性apoE基因敲除小鼠60只給予高脂飼料喂養(yǎng)（含0.15％膽固醇+21％脂肪）。
　　2.取血
　　3.分析組織形態(tài)學(xué)
　　4.評(píng)估血脂水平
　　5.ELISA法檢測各實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)

16、脈TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、eNOS、ACAT的表達(dá)水平
　　6.Western blot檢測各實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈LOX-1、NF-κB的蛋白表達(dá)及磷酸化改變
　　結(jié)果：
　　1.病理形態(tài)檢測結(jié)果
　　MP干預(yù)12周后，HE染色觀察主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)顯示正常對(duì)照組、辛伐他汀組、MP高劑量組內(nèi)膜結(jié)構(gòu)正常，沒有脂質(zhì)沉積。
　　2.對(duì)血脂水平分析
　　模型組血液中的TC，TG和LDL-

17、C濃度明顯高于正常組。
　　3.對(duì)炎癥反應(yīng)分析
　　結(jié)果表明，MP通過干預(yù)NF-κB、TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的水平，抑制炎癥反應(yīng)。
　　4.對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分析的保護(hù)作用
　　ELISA結(jié)果顯示MP可以通過提高eNOS水平，達(dá)到保護(hù)動(dòng)脈血管內(nèi)皮的作用。
　　5.對(duì)ACAT1水平的分析
　　通過ELISA法檢測各組ACAT1水平，結(jié)果表明，辛伐他汀和MP干預(yù)各組動(dòng)物，

18、可降低斑塊內(nèi)ACAT1的水平。
　　結(jié)論：
　　1.馬黛多酚調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制之一。
　　2.馬黛多酚通過抑制NF-KB信號(hào)通路的活性，降低ApoE基因敲除小鼠斑塊內(nèi)的TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等炎性因子、粘附分子、趨化因子水平，MP對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用是其抑制泡沫細(xì)胞的形成、抗動(dòng)脈粥樣硬化的另一個(gè)重要的作用機(jī)制。
　　3.馬黛多酚可以抑制ApoE-/