熒光交叉關(guān)聯(lián)光譜檢測(cè)Aβ寡聚體與kinesin-1蛋白相互作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，又稱老年性癡呆，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征為細(xì)胞外老年斑(senile plaques，SPs)和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)。雖然AD的確切病因和發(fā)病機(jī)制仍未清楚，但β淀粉樣蛋白假說(shuō)（amyloid-β，Aβ）是目前公認(rèn)的主流學(xué)說(shuō)。Aβ過(guò)產(chǎn)和/或Aβ清除障礙造成的細(xì)胞外SPs可能是其主要致病因素，

2、其中，可溶性Aβ寡聚體相對(duì)于單體和纖維狀A(yù)β則具有更強(qiáng)的毒性作用，特別是Aβ42寡聚體，可能是主要的致病因子。研究發(fā)現(xiàn)在AD患者和動(dòng)物模型中存在著軸突運(yùn)輸功能紊亂現(xiàn)象，且有證據(jù)顯示驅(qū)動(dòng)蛋白kinesin在其中扮演著重要的角色，因此，研究Aβ寡聚體與kinesin間相互作用將有助于揭示AD的發(fā)病機(jī)制，為AD的診斷與防治提供更多的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　雙色熒光交叉關(guān)聯(lián)光譜(dual color-fluorescence cross c

3、orrelation spectroscopy,DC-FCCS)是一種通過(guò)測(cè)量溶液中微小尺度內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的漲落而進(jìn)行分析的單分子熒光檢測(cè)技術(shù)，可檢測(cè)兩種熒光組分的信號(hào)，尤其適于生物大分子間相互作用的研究。雖然β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)與kinesin蛋白的直接相互作用已有體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明，但Aβ寡聚體與kinesin的直接相互作用研究還未見(jiàn)報(bào)道，尤其是在單分子水平上對(duì)二者相互作用

4、的直接觀察，因此，我們通過(guò)擴(kuò)增了kinesin-1輕鏈蛋白(kinesin light chain, KLC)的編碼序列，構(gòu)建質(zhì)粒、表達(dá)并純化了KLC-EGFP-His（以下簡(jiǎn)寫(xiě)KLC-E）和EGFP-KLC-His（以下簡(jiǎn)寫(xiě)E-KLC）兩種融合蛋白，建立了DC-FCCS觀察Aβ寡聚體與KLC融合蛋白間相互作用的的檢測(cè)方法，并探討了反應(yīng)計(jì)量關(guān)系和EGFP標(biāo)簽位置對(duì)二者作用的影響。
　　本課題選用Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

5、進(jìn)行目的蛋白的真核表達(dá)，首先擴(kuò)增KLC和EGFP編碼序列，然后分別將兩個(gè)片段按不同順序連接到pFastBac1載體上，并在各自C端連接His標(biāo)簽編碼序列;獲得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli DH10Bac感受態(tài)中，包裝重組桿狀病毒DNA分子并轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞;包裝并擴(kuò)增出強(qiáng)感染力重組桿狀病毒，分別感染Sf9細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLC-E和E-KLC融合蛋白，并進(jìn)行蛋白純化;Atto647N NHS ester熒光染料標(biāo)記Aβ42單體并制備寡聚體;Aβ4

6、2寡聚體與目的蛋白孵育并進(jìn)行DC-FCCS檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0-4 h內(nèi)，Aβ42寡聚體與KLC-E和E-KLC間結(jié)合效率均逐漸增強(qiáng);并且隨著時(shí)間推移，高、低計(jì)量反應(yīng)的KLC-E和E-KLC均會(huì)促進(jìn)Aβ42寡聚體的進(jìn)一步聚集，但在低計(jì)量反應(yīng)下，E-KLC對(duì)Aβ42寡聚化促進(jìn)程度稍大于KLC-E;高計(jì)量反應(yīng)的KLC-E和E-KLC相較于低計(jì)量反應(yīng)，與Aβ42寡聚體的結(jié)合效率更高，但無(wú)論高、低計(jì)量反應(yīng)，E-KLC與Aβ42寡聚體的結(jié)合效