土壤腐殖酸與酶蛋白相互作用的機制.pdf

1、蛋白質(zhì)是環(huán)境中重要的活性組分，主要通過動植物和微生物的分泌、殘體遺骸的分解釋放、人類的活動等進入土壤和水體環(huán)境中。這些蛋白質(zhì)既包含具有催化作用的脲酶、酸性磷酸酶等，也包含一些對環(huán)境存在潛在危害性的朊病毒、禽流感病毒等。當(dāng)它們進入環(huán)境中，很少以游離態(tài)存在，常與有機物、礦物、微生物等結(jié)合在一起。腐殖酸作為環(huán)境中重要的組分，廣泛存在于土壤、水體等環(huán)境中，可以在靜電、疏水、化學(xué)鍵等的驅(qū)使下以吸附、共聚或者包埋等作用機制與蛋白質(zhì)發(fā)生作用。本文主要

2、以腐殖酸和溶菌酶為研究對象，從膠體性質(zhì)的角度出發(fā)，在了解兩者表面電荷性質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過研究pH值、離子強度、復(fù)合物質(zhì)量比、腐殖酸類型等對兩者作用過程中電化學(xué)性質(zhì)以及對酶活性、結(jié)構(gòu)的影響，進一步揭示兩者的主要作用機制。主要結(jié)果如下:
　　 1.闡明了膠體表面絕對電荷量的測定方法，在酸堿滴定和Stat-pH滴定的基礎(chǔ)上，通過測定曲線上某一點處的絕對電荷量，經(jīng)過平移最終得到了不同離子強度下腐殖酸表面絕對電荷量隨pH值變化的曲線。絕對電

3、荷的測定方法需要根據(jù)樣品的性質(zhì)來選擇，本文對采用聚電解質(zhì)滴定法和采用改變樣品溶液pH值和離子強度計算質(zhì)子解離量來測定腐殖酸表面絕對電荷量的兩種方法進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于胡敏酸而言，聚電解質(zhì)滴定法測得的結(jié)果大于酸堿滴定的結(jié)果;富里酸不適合采用聚電解質(zhì)滴定法進行測定，測定結(jié)果偏低。
　　 2.采用顆粒電荷滴定儀測定了腐殖酸滴定溶菌酶的過程中電勢(mV)以及pH值的變化。根據(jù)電勢的變化計算達到復(fù)合物等電點時腐殖酸與溶菌酶的電中性質(zhì)量

4、比(mHS/mLSZ) IEP，結(jié)果表明腐殖酸與溶菌酶之間具有較高的分子親和力，電中性質(zhì)量比(mHS/mLSZ)IEP隨離子強度的增加而增加，隨pH值的升高而下降。并與理論得到的電荷補償質(zhì)量比(mHS/mLSZ)CCP進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(mHS/mLSZ)IEP＞(mHS/mLSZ) CCP，這是因為K+參與復(fù)合物的形成，且其參與量隨著離子強度的增加而增加，隨著pH值的升高而下降。此外，K+的參與量還與腐殖酸的類型有關(guān)，在JGFA與溶

5、菌酶復(fù)合物中的參與量最大，而在PAHA與溶菌酶復(fù)合物中的參與量最小。
　　 3.觀察了不同質(zhì)量比的腐殖酸與溶菌酶復(fù)合物隨時間變化的絮凝現(xiàn)象，結(jié)果表明腐殖酸與溶菌酶的復(fù)合物在等電點處的絮凝現(xiàn)象最明顯，較短的時間內(nèi)出現(xiàn)了大量的絮凝物。對于胡敏酸與溶菌酶的復(fù)合物而言，較大的質(zhì)量比不易于絮凝物的產(chǎn)生，帶負(fù)電荷的復(fù)合物分子之間存在的靜電排斥力促進了復(fù)合物解聚的發(fā)生，抑制了絮凝物的產(chǎn)生。
　　 4.腐殖酸與蛋白質(zhì)的作用過程中，通過測

6、定復(fù)合物中酶活性的變化來反映溶液pH值、離子強度、復(fù)合質(zhì)量比對復(fù)合物形成、電荷性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等方面的影響，從而進一步揭示兩者的作用機制。結(jié)果表明靜電作用力在腐殖酸與蛋白質(zhì)之間起著重要的作用。在靜電引力的驅(qū)動下，溶菌酶被腐殖酸包被在其分子結(jié)構(gòu)中，底物接觸活性位點受阻導(dǎo)致活性降低。在兩者的作用過程中，復(fù)合物的質(zhì)量比起著重要的作用，決定了復(fù)合物表面所帶的電荷量以及復(fù)合物分子的結(jié)構(gòu)。此外，離子強度對腐殖酸和溶菌酶之間的靜電屏蔽作用與質(zhì)量比有關(guān)，在等

7、電點前后其對酶活的作用相反，進一步表明靜電作用在兩者之間的重要性。富里酸分子量低、結(jié)構(gòu)簡單，對溶菌酶包被的程度以及對酶活性的抑制程度均小于胡敏酸。腐殖酸與兩性分子脲酶的靜電作用受溶液pH值的影響:pH值大于脲酶等電點時，兩者之間存在靜電排斥作用;pH值小于脲酶等電點時，兩者之間主要以靜電引力為主。離子強度對腐殖酸和脲酶之間的靜電作用力同樣具有屏蔽作用。腐殖酸降低了溶菌酶的穩(wěn)定性，且在電中性質(zhì)量比處穩(wěn)定性最低。相反，腐殖酸的加入減弱了脲酶

8、分子之間的碰撞從而提高了脲酶的穩(wěn)定性。
　　 5.采用熒光光譜法研究了腐殖酸與溶菌酶的作用對色氨酸微環(huán)境的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH5及5 mmol L-1 KC1時，腐殖酸對溶菌酶在340 nm處的熒光峰產(chǎn)生猝滅作用（激發(fā)波長為280 nm）。隨著復(fù)合物質(zhì)量比的增加，熒光猝滅的程度增強，當(dāng)質(zhì)量比大于0.2時，溶菌酶在該處的熒光發(fā)射峰幾乎消失;340 nm處的熒光峰主要由色氨酸貢獻，隨著腐殖酸質(zhì)量的增加，色氨酸的熒光發(fā)射峰逐漸發(fā)生紅移，

9、表明腐殖酸與溶菌酶的結(jié)合使得色氨酸殘基附近的微環(huán)境發(fā)生了變化，極性增強，疏水性降低，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得疏松。
　　 6.采用圓二色譜法測定了在腐殖酸與溶菌酶復(fù)合過程中，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAHA、JGHA與溶菌酶的復(fù)合物中，α螺旋、自由卷曲的含量均隨著質(zhì)量比的增加呈先下降后上升的趨勢，在等電點處形成一個拐點，與復(fù)合物酶活性隨質(zhì)量比的變化趨勢一致。β折疊的含量隨質(zhì)量比的增加呈先上升后下降的變化趨勢，同樣在等電點處形成一個

10、拐點，拐點為胡敏酸對溶菌酶包被和解聚的一個轉(zhuǎn)折點。對于JGFA來說，α螺旋、轉(zhuǎn)角、自由卷曲的含量均隨著復(fù)合物質(zhì)量比的增加而增加，而β折疊則隨著質(zhì)量比的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，在電中性質(zhì)量比f=0.6時均未出現(xiàn)拐點。
　　 7.采用衰減全反射紅外光譜法研究了復(fù)合時間、質(zhì)量比、pH值、離子強度等對復(fù)合物紅外光譜的影響。當(dāng)質(zhì)量比f=（mHA/mLSZ）IEP時，腐殖酸對酶的包被程度達到最大，溶菌酶的紅外吸收峰均受到了較大程度的抑制。隨著p