南極大磷蝦胰蛋白酶分離純化及其促進創(chuàng)傷修復作用研究.pdf

1、南極大磷蝦(Euphausia superba)隸屬于節(jié)肢動物門甲殼綱，是生活在南極海域的一種嗜冷生物，以其巨大的生物量和潛在的應用價值日益受到人們的關注。南極大磷蝦體內含有多種蛋白酶，蛋白降解系統(tǒng)較為獨特而且降解效率較高，而這些蛋白酶活性40％來源于胰蛋白酶。其胰蛋白酶是一種適冷酶，在低溫下具有較高的催化活性，并且具有較低的最適催化溫度，由于南極大磷蝦體內蛋白酶系統(tǒng)同時具有外切酶和內切酶活性，用于清除壞死機體組織、纖維以及血痂非常有效

2、，能顯著加快傷口愈合，因此，南極大磷蝦酶制劑具有廣泛的醫(yī)學用途。
　　 本實驗從南極大磷蝦體內提取胰蛋白酶。通過采用20-70％硫酸銨分級沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephacry1 S100凝膠過濾層析，然后將樣品進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)純化得到一種分子量為32.0KDa的胰蛋白酶組分，作為動物實驗中所用的純化酶。
　　 采用全層皮膚缺損法建立新西蘭大白兔創(chuàng)傷模型，在兔背后造

3、4個約2cm×2cm方形創(chuàng)面，將創(chuàng)面分為粗酶組、純化酶組、木瓜蛋白酶組和生理鹽水組四組，每天給藥兩次，每次0.5mL，直至傷口愈合。連續(xù)觀察創(chuàng)面形態(tài)學變化，評價創(chuàng)傷表面瘢痕、測量傷口表面積、觀察創(chuàng)傷組織切片、測定皮膚羥脯氨酸含量比較各組創(chuàng)傷愈合效果。結果顯示，相比于木瓜蛋白酶，從南極大磷蝦中提取的粗酶和純化的胰蛋白酶具有良好的促進愈合效果，尤其是粗酶，能明顯促進動物創(chuàng)面的愈合，并明顯縮短創(chuàng)面愈合時間，還能顯著提高在創(chuàng)傷15天羥脯氨酸含量

4、。初步表明南極磷蝦胰蛋白酶有增加膠原沉積，增加蛋白質合成，加速上皮組織再生，促進肉芽組織形成等作用。
　　 EGF及bFGF是影響創(chuàng)傷修復的兩種比較關鍵的生長因子。測定表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)含量。建模后第十天、十五天，粗酶組和純化酶組EGFR、bFGF的表達水平較高，相較于木瓜蛋白酶組和生理鹽水組差異顯著，且粗酶組EGFR、bFGF的表達速度最快(10天左右達到最高峰)，因而認為粗酶可能通過調