麥冬皂苷類成分對(duì)NSCLC的體外抑制作用及相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要類型，約占其75.0％的比例。在NSCLC中，鱗癌與腺癌所占的比例又是最高的，約占80.0％以上。
　　中醫(yī)藥在癌癥的治療中對(duì)于穩(wěn)定瘤體、改善癥狀、防止復(fù)發(fā)和提高生活質(zhì)量等方面具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，但其作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步闡明，科學(xué)化使用程度有待進(jìn)一步提高。
　　“麥門冬湯合千金葦莖湯”（來(lái)自《金匱要略》）及“周氏克金巖方”（來(lái)自國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授）均為臨床抗肺癌的有效驗(yàn)方，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)

2、果表明，其均能抑制Lewis肺癌及A549、H157肺癌荷瘤小鼠模型體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。在這兩張抗肺癌的重要方劑中，麥冬均作為一味不可或缺的中藥組分，課題組前期對(duì)其有效部位及活性成分抗非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的作用進(jìn)行了細(xì)胞水平的高通量篩選，結(jié)果表明其皂苷類成分具有顯著的體外抗NSCLC的作用，但其相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
　　本研究以NSCLC中普遍過(guò)度活化的PI3K/Akt

3、/mTOR信號(hào)通路為切入點(diǎn)，通過(guò)研究麥冬皂苷類細(xì)胞毒成分對(duì)NSCLC中鱗癌、大細(xì)胞癌和腺癌等不同病理分型細(xì)胞株的藥理學(xué)活性及差異，揭示中藥有效成分抗NSCLC的機(jī)理，同時(shí)為臨床分子靶向性治療藥物的研究和開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。本論文具體開(kāi)展工作如下:
　　1魯斯可皂苷元(Ruscogenin)、麥冬皂苷B(ophiopogonin B，OP-B)、麥冬皂苷D(ophiopogonin D，OP-D)三種麥冬皂苷體外抗NSCLC活性

4、的初步篩選以肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H157為研究對(duì)象，通過(guò)藥物作用后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)和對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行分析，對(duì)三種麥冬皂苷類化合物Ruscogenin、OP-D和OP-B抗NSCLC的藥理學(xué)活性進(jìn)行初步的篩選。結(jié)果表明:OP-D各給藥濃度、給藥時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期沒(méi)有顯著影響;Ruscogenin和OP-B在給藥24 h后導(dǎo)致NCI-H157細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期;在對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的作用上，Ru

5、scogenin對(duì)整條通路沒(méi)有顯著影響，OP-D對(duì)該通路下游的eIF4B有顯著激活作用，而OP-B則主要抑制通路上游Akt和p70S6K的磷酸化激活，對(duì)下游的eIF4B及eEF2K的磷酸化沒(méi)有顯著影響。
　　2 OP-B對(duì)肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H157和大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460藥理活性的研究倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)這兩種細(xì)胞株發(fā)生空泡樣死亡，cleavedCaspase-3、Bcl-2等的Western blot檢測(cè)以及

6、Annexin-V/PI/Hoechest33258熒光染色結(jié)合高內(nèi)涵分析發(fā)現(xiàn)該死亡方式不屬于凋亡。自噬金指標(biāo)LC3-Ⅰ向Ⅱ轉(zhuǎn)化水平的Western blot檢測(cè)結(jié)合自噬空泡的電鏡觀察結(jié)果證明OP-B在H157和H460細(xì)胞株中誘導(dǎo)的均為Ⅱ型程序性死亡，即自噬。通過(guò)對(duì)調(diào)控自噬的關(guān)鍵信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)OP-B對(duì)通路中Akt和p70s6k的磷酸化抑制均呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。通過(guò)和PI3K的抑制劑LY29400

7、2以及mTOR抑制劑Rapmycin進(jìn)行比較，并通過(guò)胰島素對(duì)信號(hào)通路進(jìn)行給藥后誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)OP-B對(duì)Akt磷酸化的抑制作用較為專一，且是OP-B誘導(dǎo)自噬的原因。
　　3 OP-B對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549的自噬和凋亡誘導(dǎo)活性研究臨床肺腺癌的發(fā)病率最高，治療最為棘手，在OP-B對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549的作用中發(fā)現(xiàn)，OP-B通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，早期誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，進(jìn)而誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，而且通過(guò)對(duì)自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1的

8、SiRNA干擾實(shí)驗(yàn)證明，自噬是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。
　　4 OP-B對(duì)H460和A549細(xì)胞周期調(diào)控的差異性比較進(jìn)一步對(duì)OP-B在A549和H460細(xì)胞株中的周期調(diào)控情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)OP-B在A549中主要通過(guò)上調(diào)周期抑制蛋白p21和p27的表達(dá)和抑制CyclinA2、CDK2、CyclinB1的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在S和G2/M期;而在H460中，OP-B對(duì)周期的調(diào)控較弱，主要通過(guò)抑制CyclinB1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻

9、滯在G0/G1期。
　　5 OP-B對(duì)A549細(xì)胞侵襲及遷移的體外研究細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明，OP-B在誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的同時(shí)，還抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。并且對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)控和調(diào)節(jié)Akt的磷酸化及EphA2受體的表達(dá)有一定關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論
　　在幾種麥冬甾體皂苷類化合物中，二糖苷OP-B為主要的細(xì)胞毒成分，其對(duì)于不同病理分型的NSCLC細(xì)胞株具有不同的藥理學(xué)活性。在肺鱗癌和大細(xì)胞癌細(xì)胞株中，OP-B

10、主要誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬;而在肺腺癌細(xì)胞株中，OP-B早期誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，晚期誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　通過(guò)對(duì)OP-B在三種NSCLC細(xì)胞株中作用機(jī)制的差異性比較發(fā)現(xiàn)，其主要差別在于對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控上，在H157和H460中主要誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，而在A549中則將細(xì)胞周期阻滯在S和G2/M期。通過(guò)對(duì)p-Akt的抑制，OP-B在誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)，還能抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。在分屬鱗癌、大細(xì)胞癌和腺癌三種不同病理亞型