雙參寧心膠囊干預(yù)心肌缺血的分子機(jī)制研究.pdf

1、心肌缺血引起的心血管疾病是當(dāng)前死亡率最高的疾病之一。目前臨床上用于治療心肌缺血的藥物有多種，但存在著這樣或那樣的問(wèn)題。因此，利用現(xiàn)代心血管生命現(xiàn)象研究的成果，對(duì)中藥治療心血管病的藥理作用進(jìn)行深入研究，尋找新的作用靶點(diǎn)，探討其作用機(jī)理，對(duì)中藥現(xiàn)代化進(jìn)程及中藥新藥研制，具有十分重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。 雙參寧心膠囊(SSNX)是提取人參總皂苷、丹參總酚酸、元胡總生物堿三種有效組分配伍而成，本室已建立了該方的體外及血液中單一化學(xué)成分

2、的含量測(cè)定方法和所測(cè)化學(xué)成分的指紋圖譜方法，藥效學(xué)研究表明，該方能明顯減輕急性心肌缺血犬和大鼠的心肌損傷程度，對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用。但SSNX抗心肌缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)理尚不清楚，因此開展復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究和機(jī)理探討有助于為其臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本文首先探討了SSNX干預(yù)心肌缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)合血清藥物化學(xué)研究成果，建立了心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，對(duì)SSNX的全方、組分、成分分別進(jìn)行了藥理學(xué)研究。 在此基礎(chǔ)上，我

3、們又研究了SSNX全方及其有效成分對(duì)心肌細(xì)胞鈣超載的影響，觀察了胞漿鈣離子濃度、鈣泵、L型鈣通道電流(ICa-L)、L型鈣通道m(xù)RNA表達(dá)等指標(biāo)，從鈣超載角度，進(jìn)一步闡明了SSNX干預(yù)心肌缺血的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 第一部分雙參寧心膠囊干預(yù)心肌缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)研究1雙參寧心膠囊及其成分對(duì)大鼠心肌細(xì)胞活力的影響應(yīng)用MTT法，觀察雙參寧心膠囊成分、組分及全方對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)(1-1000mg/L

4、)，SSNX對(duì)心肌細(xì)胞活力無(wú)影響(P＞0.05)。而其3個(gè)組分人參總皂苷、丹參總酚酸、元胡總生物堿高劑量時(shí)(1000mg/L)均表現(xiàn)出了對(duì)心肌細(xì)胞活力的抑制作用(P＜0.001)。其成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、丹酚酸B、延胡索乙素、脫氫紫堇堿(在100μmol/L以內(nèi))對(duì)心肌細(xì)胞活力無(wú)影響(P＞0.05)。 2雙參寧心膠囊及其成分對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響利用體外心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，觀察了雙參寧心膠囊成

5、分、組分及全方對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH活性的影響。結(jié)果表明：人參皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙素、脫氫紫堇堿均可抑制缺氧/復(fù)氧損傷造成的心肌細(xì)胞LDH的漏出(P＜0.05)，其中丹酚酸B、延胡索乙素作用顯著(P＜0.01)。而人參皂苷Re對(duì)LDH的漏出無(wú)影響(P＞0.05)。 SSNX的3個(gè)組分人參總皂苷、丹參總酚酸、元胡總生物堿均可抑制缺氧/復(fù)氧損傷造成的心肌細(xì)胞LDH的漏出(P＜0.05)，其中丹參總酚酸作用最為顯著(P＜0.0

6、1)。 SSNX可以抑制缺氧/復(fù)氧損傷造成的心肌細(xì)胞LDH的漏出，其作用顯著(P＜0.01)。 提示配伍而成的SSNX對(duì)體外心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型具有治療作用；人參皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙素、脫氫紫堇堿為SSNX干預(yù)心肌缺血的有效成分，可能是其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，而丹參總酚酸、丹酚酸B可能發(fā)揮了重要作用。 第二部分雙參寧心膠囊及其有效成分對(duì)心肌細(xì)胞鈣離子影響的研究1雙參寧心膠囊及其有效成分干預(yù)大鼠心肌細(xì)胞缺

7、氧/復(fù)氧損傷鈣超載機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究1.1對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響采用熒光分光光度法，觀察SSNX及其有效成分對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響：結(jié)果顯示：SSNX及其成分丹酚酸B、脫氫紫堇堿能有效抑制缺氧/復(fù)氧后的心肌細(xì)胞胞漿[Ca2+]i濃度的增加(P＜0.05)。表明SSNX、丹酚酸B、脫氫紫堇堿能減輕心肌細(xì)胞鈣超載，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。 1.2對(duì)心肌細(xì)胞Na+K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影

8、響采用比色法，觀察SSNX及其有效成分對(duì)心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影響：結(jié)果顯示：SSNX、脫氫紫堇堿能恢復(fù)缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低(P＜0.05)。表明SSNX能通過(guò)抑制Na+/Ca2+交換作用、增強(qiáng)質(zhì)膜、肌漿網(wǎng)鈣泵攝取能力而減輕鈣超載。 1.3對(duì)心肌細(xì)胞L型鈣通道α1亞單位mRNA表達(dá)的影響采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈

9、式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，觀察SSNX及有效其成分對(duì)心肌細(xì)胞L型鈣通道α1亞單位mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：SSNX、丹酚酸B能抑制缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的L型鈣通道α1亞單位mRNA的表達(dá)增高(P＜0.05)，通過(guò)作用于L型鈣通道抑制Ca2+跨膜內(nèi)流，減輕鈣超載。而脫氫紫堇堿對(duì)L型鈣通道m(xù)RNA的表達(dá)無(wú)影響(P＞0.05)。 1.4對(duì)心肌細(xì)胞MDA含量的影響觀察SSNX及其有效成分對(duì)心肌細(xì)胞MDA含量的影響。結(jié)果顯示：SSNX、丹

10、酚酸B、脫氫紫堇堿能降低缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞MDA含量增高(P＜0.05)。提示SSNX能通過(guò)對(duì)抗氧自由基，抑制鈣超載。 1.5對(duì)Ca2+依賴性及非Ca2+依賴性NOS活性及NO含量的影響觀察SSNX及其有效成分對(duì)心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清Ca2+依賴性及非Ca2+依賴性NOS活性(iNOS)及NO含量的影響。結(jié)果顯示：SSNX、丹酚酸B、脫氫紫堇堿能抑制總NOS、iNOS活性及NO含量的升高(P＜0.05)。 2雙參寧心膠囊

11、及其有效成分對(duì)大鼠心肌細(xì)胞L型鈣通道電流的影響急性分離成鼠心肌細(xì)胞，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察了SSNX及其有效成分對(duì)大鼠心肌細(xì)胞L型鈣通道電流(ICa-L)的影響，結(jié)果顯示：SSNX、丹酚酸B均可抑制ICa-L(P＜0.05)，呈濃度依賴性，使ICa-L的I-V曲線上移，但不發(fā)生明顯偏移，其形態(tài)亦不發(fā)生明顯改變，也不改變ICa-L的最大激活電壓和反轉(zhuǎn)電位。而另一成分脫氫紫堇堿則對(duì)ICa-L沒有影響(P＞0.05)。 以上研究結(jié)

12、果表明，SSNX抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的有效物質(zhì)基礎(chǔ)為血清中四個(gè)指征成分人參皂苷Rg1、丹酚酸B、延胡索乙索、脫氫紫堇堿，其中丹酚酸B起了重要作用。其抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的機(jī)理與其抑制缺氧/復(fù)氧時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+過(guò)負(fù)荷有關(guān)。SSNX可以提高細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性、抑制Na+/Ca2+交換、抑制ICa-L、抑制L型鈣通道的表達(dá)、抗氧化、抑制NOS-NO系統(tǒng)，保護(hù)細(xì)胞膜，