牛膝多肽神經(jīng)保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：觀察牛膝多肽(ABPP)的神經(jīng)保護作用及其相關(guān)作用機制。 方法： (1)采用大腦中動脈線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，通過測定神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死百分比(TTC法)，在體觀察牛膝多肽的神經(jīng)保護作用。 (2)以體外原代培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，建立N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)損傷模型。通過MTT檢測，離體觀察牛膝多肽的神經(jīng)保護作用。 (3)

2、Hoechst33258/PI雙染色、PI流式細胞儀檢測、LDH檢測、DNAladder檢測等觀察牛膝多肽對NMDA誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元調(diào)亡的影響。 (4)利用鈣離子熒光探針Fluo-3/AM標記海馬神經(jīng)元，通過激光共聚焦顯微鏡檢測，觀察牛膝多肽對NMDA引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 (5)通過Western blot，觀察牛膝多肽對NMDA引起的海馬神經(jīng)元Bax蛋白過表達的影響。 (6)通過Caspase

3、-3活性檢測，觀察牛膝多肽對NMDA引起的海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白活性增高的影響。 (7)采用親脂性陽離子熒光染料Rhodamine123、分子探針DCFH-DA標記海馬神經(jīng)元，通過多功能酶標儀檢測NMDA引起的海馬神經(jīng)元線粒體跨膜電位、活性氧自由基含量的變化。同時觀察牛膝多肽對NMDA引起的海馬神經(jīng)元線粒體跨膜電位、活性氧自由基含量的影響。 (8)采用全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察牛膝多肽對NMDA電流峰值、平臺期電流

4、值、失敏系數(shù)的影響。 (9)采用了含NR2A、NR2B兩種不同亞單位類型NMDA受體的選擇性抑制劑：Ro-256981、NVP-AAM007，及兩種不同培養(yǎng)時間的海馬神經(jīng)元：體外培養(yǎng)8天、13-14天，通過MTT檢測，觀察兩種不同的選擇性抑制劑對NMDA誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的影響，同時觀察牛膝多肽對NMDA誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的影響。 (10)應(yīng)用鈣離子熒光探針Fluo-3/AM標記通過激光共聚焦顯微鏡檢測，觀察含NR2A、NR2B

5、兩種不同亞單位類型NMDA受體的選擇性抑制劑：Ro-256981、NVP-AAM007，對NMDA和Bicuculline引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，并觀察牛膝多肽對含NR2A、NR2B兩種不同亞單位類型NMDA受體介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 (11)采用全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察含NR2A、NR2B兩種不同亞單位類型NMDA受體的選擇性抑制劑：Ro-256981、NVP-AAM007，對NMDA電流峰值、平臺期電流值、

6、失敏系數(shù)的影響，并觀察牛膝多肽對含NR2A、NR2B兩種不同亞單位類型NMDA受體介導(dǎo)的NMDA電流峰值、平臺期電流值、失敏系數(shù)的影響。 結(jié)果： (1)局灶性腦缺血再灌注損傷能引起大鼠死亡，死亡率達到50％，對存活的大鼠，其神經(jīng)功能缺陷評分明顯增高和腦梗死百分比增加，尾靜脈給予牛膝多肽(0．2mg/kg)治療，可以降低神經(jīng)功能缺陷評分，降低腦梗死百分比。 (2)通過MTT檢測結(jié)果顯示，NMDA能降低培養(yǎng)的海馬神經(jīng)

7、元的活力，而且隨著NMDA濃度的增加、作用時間的延長，神經(jīng)元的活力逐漸下降。牛膝多肽能抑制NMDA引起的海馬神經(jīng)元活力下降，并與其劑量相關(guān)。 (3)Hoechst33258/PI雙染色、PI流式細胞儀檢測、LDH檢測、DNA ladder檢測結(jié)果顯示，NMDA能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元調(diào)亡，牛膝多肽(1μg/ml)能拮抗NMDA誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元調(diào)亡。 (4)鈣實時成像結(jié)果顯示，NMDA能引起海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣熒光強度增加，并隨著NM

8、DA濃度增加，熒光強度增強。AP-V、MK801能抑制胞內(nèi)鈣熒光強度增高。預(yù)先、同時、后加入牛膝多肽都能減弱NMDA引起海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣熒光強度增加，并隨著濃度增高，抑制程度增加。 (5)通過MTT檢測結(jié)果顯示，Bax通道阻斷劑能拮抗NMDA引起的海馬神經(jīng)元活力的降低。RT-PCR和Western blot結(jié)果提示，海馬神經(jīng)元Bax mRNA及其蛋白表達隨著NMDA作用時間的變化而變化，其中作用30min Bax蛋白表達明顯增加

9、。牛膝多肽能拮抗NMDA損傷引起的海馬神經(jīng)元Bax蛋白表達增高。 (6)多功能酶標儀實時測定結(jié)果顯示，分子探針DCFH-DA氧化后形成的熒光產(chǎn)物DCF的熒光強度，隨著NMDA濃度的增加而逐漸增高，而牛膝多肽能抑制NMDA引起的熒光強度增強，并隨著其濃度的增加，其抑制程度逐漸增強。 (7)多功能酶標儀實時測定線粒體跨膜電位，結(jié)果顯示NMDA能引起線粒體跨膜電位明顯下降，而牛膝多肽能拮抗線粒體跨膜電位的下降。 (8)

10、Caspase-3活性檢測結(jié)果顯示，NMDA能引起海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白活性增強，牛膝多肽能拮抗NMDA引起海馬神經(jīng)元Caspase-3活性增強。 (9)通過MTT檢測結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)8天、13-14天的海馬神經(jīng)元，NMDA都能引起細胞活力急性下降，Ro-256981、NVP-AAM007能拮抗NMDA引起的細胞活力下降，然而牛膝多肽不能抑制NMDA引起的急性細胞活力下降。體外培養(yǎng)8天、13-14天的海馬神經(jīng)元，Ro

11、-256981能拮抗NMDA引起的遲發(fā)性細胞活力下降。體外培養(yǎng)8天的海馬神經(jīng)元，NVP-AAM007能拮抗NMDA引起的遲發(fā)性細胞活力下降，牛膝多肽(0．1μg/ml)能拮抗NMDA引起的遲發(fā)性細胞活力下降，而牛膝多肽(10μg/ml)不能拮抗NMDA引起的細胞活力遲發(fā)性下降，但NVP-AAM007能恢復(fù)牛膝多肽拮抗NMDA引起的遲發(fā)性細胞活力下降作用。體外培養(yǎng)13-14天的海馬神經(jīng)元，NVP-AAM007能加劇NMDA引起的細胞活力遲

12、發(fā)性下降。牛膝多肽(10μg/ml)能明顯抑制NMDA引起的遲發(fā)性細胞活力下降。 (10)鈣實時成像結(jié)果顯示，NVP-AAM007、Ro-256981能部分抑制NMDA引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣熒光強度增加。當(dāng)NVP-AAM007存在的時候，牛膝多肽能抑制NMDA引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣熒光強度增加。當(dāng)Ro-256981存在的時候，牛膝多肽能增強NMDA引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣熒光強度增加。NVP-AAM007、Ro-256981能部分

13、抑制Bicuculline引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣熒光強度增加。當(dāng)NVP-AAM007存在的時候，牛膝多肽能抑制Bicuculline引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣熒光強度增加。當(dāng)Ro-256981存在的時候，牛膝多肽能增強Bicuculline引起的海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣熒光強度增加。 (11)全細胞模式記錄NMDA電流，結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)8天的海馬神經(jīng)元，牛膝多肽能降低NMDA平臺期電流值，增加其失敏系數(shù)；培養(yǎng)13—14天的海馬神經(jīng)元，牛膝

14、多肽能使NMDA電流峰值、平臺期電流值增高，但降低其失敏系數(shù)。Ro-256981、NVP-AAM007能降低NMDA電流峰值、平臺期電流值。當(dāng)NVP-AAM007存在的時候，牛膝多肽能減低NMDA電流峰值、平臺期電流值、失敏系數(shù)；當(dāng)Ro-256981存在的時候，牛膝多肽能增強NMDA電流峰值、平臺期電流值，降低其失敏系數(shù)。 結(jié)論： (1)牛膝多肽在離體和在體具有神經(jīng)保護作用。 (2)牛膝多肽通過抗神經(jīng)元調(diào)亡實現(xiàn)神