胰高血糖素樣多肽-2的重組表達及其對腸道保護作用機制的實驗研究.pdf

1、目的意義： 嚴重燒傷后造成腸粘膜血流量下降，腸粘膜組織損傷及通透性增加，使腸道屏障功能障礙，造成腸道細菌移位，引發(fā)多器官功能障礙，是導致傷后高代謝的重要原因。因此促進嚴重燒傷后腸道修復，能減輕臟器炎癥反應，防止腸源性感染，改善代謝障礙，加快創(chuàng)面愈合，是臨床救治重要措施之一。腸道作為人體最大的內(nèi)分泌器官，其自身分泌許多腸道激素對腸道結(jié)構(gòu)功能起著重要的保護作用，隨著近年來對胰高血糖素樣多肽-2(Glucagonslikepeptid

2、e2,GLP-2)認識的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其對腸道有特異性保護作用。且有廣泛臨床應用前景。 本研究利用基因重組技術(shù)設計構(gòu)建了GLP-2原核表達載體并誘導表達，初步觀察其對燒傷后大鼠腸道及腸上皮細胞的保護作用，利用體外細胞模型，探討GLP-2促細胞增殖的作用機制及調(diào)控因素，為今后臨床應用提供理論依據(jù)。 材料與方法： 1.利用pET31b(+)表達載體，對GLP-2序列進行重組設計，構(gòu)建表達質(zhì)粒進行原核表達，優(yōu)化條件后表

3、達并進行親和層析純化、脫鹽。溴化氰裂解后行westernblot(WB)鑒定，并低溫干燥保存。 2.采用30％TBSAⅢ度燒傷大鼠模型作為體內(nèi)實驗模型，隨機分為正常對照組(N)；燒傷對照組(C)；重組GLP-2治療組(Gr)及化學合成GLP-2治療組(G)。檢測大鼠傷后第7天腸粘膜通透性，腸粘膜濕重與腸段及軀殼重比，腸粘膜蛋白及腸道病理形態(tài)學的變化。RT-PCR及WB檢測GLP-2R的表達，利用脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達GLP-

4、2R的Caco-2/GLP-2R(+)細胞作為體外研究模型，隨機分為正常對照組(N)；缺氧對照組(C)；缺氧后重組GLP-2處理組(Gr)及缺氧后化學合成GLP-2處理組(G)。觀察不同GLP-2對缺氧后細胞增殖、乳酸脫氫酶及蔗糖酶活性的影響，并檢測細胞CDK4及ZO1蛋白表達的變化。 3.構(gòu)建caveolin-1/pEGFPN2質(zhì)粒及體外合成caveolin-1siRNA后瞬時轉(zhuǎn)染Caco-2/GLP-2R(+)細胞，將細胞分

5、為正常對照組(AN)、缺氧對照組(AC)、缺氧后GLP-2處理組(AG)、caveolin-1上調(diào)細胞缺氧后GLP-2處理組(CG)、caveolin-1下調(diào)細胞缺氧后GLP-2處理組(EG)，檢測細胞cAMP濃度，GRK2(ser280)磷酸化蛋白變化及細胞增殖，同時應用信號通路抑制劑觀察GLP-2信號轉(zhuǎn)導，WB檢測ERK信號轉(zhuǎn)導通路中相關(guān)蛋白及Akt(ser473)蛋白磷酸化表達的變化，免疫共沉淀檢測caveolin-1與GLP-2

6、R的作用。觀察GLP-2對缺氧后細胞增殖信號轉(zhuǎn)導途徑的影響以及caveolin-1對GLP-2R跨膜信號的調(diào)控。 結(jié)果： 1.成功設計構(gòu)建GLP-2/pET31b(+)質(zhì)粒質(zhì)粒，測序正確；在BLR(DE3)感受態(tài)大腸桿菌種誘導表達最佳條件為1mMIPTG誘導表達4h，通過親和層析純化及溴化氰裂解法獲得單體GLP-2約100mg，重組得率5mg/100ml。 2.給予重組GLP-2及合成GLP-2后，燒傷后第7天，

7、與燒傷對照組相比，大鼠的腸粘膜通透性明顯降低，腸粘膜蛋白含量、腸粘膜與腸段重及與軀殼重之比均明顯升高(P＜0.05)，而兩種GLP-2之間差異無顯著性意義(P＞0.05)。形態(tài)學觀察兩種GLP-2均能減輕燒傷后腸粘膜病理損傷。體外實驗結(jié)果顯示，細胞嚴重缺氧8h立即加入1000nM的GLP-2，24、72h后能夠明顯增加Caco-2/GLP-2R(+)細胞的細胞增殖(P＜0.05)，重組GLP-2與合成GLP-2效果無明顯差別(P＞0.0

8、5)。而GLP-2處理72小時后，細胞乳酸脫氫酶及蔗糖酶活性無明顯變化(P＞0.05)。CDK4及ZO1蛋白表達較缺氧對照組增強。 缺氧后立即給予1000nM的GLP-2處理，24h后，缺氧對照組cAMP含量明顯降低(P＜0.01)，而GLP-2處理組的cAMP卻維持在一個較高水平。CG組細胞的cAMP明顯增加，而EG組cAMP含量下調(diào)。GLP-2處理24h后，能夠明顯增加缺氧細胞的增殖(P＜0.05)，在CG組細胞增殖更加明顯

9、(P＜0.05)，EG組增殖作用下降。GLP-2處理后30min，磷酸化GRK2蛋白表達較缺氧對照組增強，無論上調(diào)或下調(diào)caveolin-1后，磷酸化GRK-2表達下降。給予不同信號通路抑制劑后發(fā)現(xiàn)，MEK1/2特異性抑制劑U0126及P13特異抑制劑LY294002能夠明顯抑制GLP-2的促增殖作用(P＜0.05)，而P38特異性抑制劑SB203580卻不能抑制GLP-2促增殖作用。缺氧后給予GLP-2能增強ERK信號途徑中c-Raf

10、、MEK1/2、ERK1/2及核內(nèi)p90RSK磷酸化蛋白的表達，也能增強P13信號途徑中Akt磷酸化蛋白的表達。caveolin-1上調(diào)后ERK信號通路中相關(guān)磷酸化蛋白的表達增強增強，caveolin-1下調(diào)后相關(guān)磷酸化蛋白的表達減弱。 結(jié)論： 1.構(gòu)建GLP-2原核表達載體。誘導表達純化，為GLP-2獲得提供了一種新的方法。 2.重組GLP-2及化學合成GLP-2能夠降低嚴重燒傷后大鼠腸粘膜通透性，增加粘膜重量

11、及蛋白含量，減輕腸粘膜的損傷程度。對Caco2/GLP-2R(+)細胞具有明顯的促增殖作用，但對細胞無明顯毒性，對蔗糖酶活性沒有明顯的影響，能夠增強缺氧后細胞CDK4及ZO1蛋白表達，可能參與了細胞分裂及細胞間緊密連接的調(diào)控機制。 3.GLP-2對細胞的促增殖作用伴有cAMP的增加，而磷酸化GRK2蛋白負反饋機制可能參與了對cAMP的調(diào)控。GLP-2對細胞增殖的作用依賴于ERK及P13途徑，其可以引起c-Raf,MEK1/2，E