洛伐他汀非膽固醇依賴機(jī)制性神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：史他汀類藥物對(duì)神經(jīng)退變性疾病的臨床治療已引起高度重視，但其作用機(jī)制仍不十分清楚。為此，本研究采用體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，觀察他汀類中的洛伐他汀是否能對(duì)抗β-淀粉樣肽（β-Amyloid peptide，Aβ）、岡田酸(Okadaic acid,OKA)、氟化物等引起的神經(jīng)毒性作用，重點(diǎn)研究洛伐他汀對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）發(fā)病中的關(guān)鍵物質(zhì)，如淀粉樣前體蛋白（Amyloid Precursor Prot

2、ein，APP）的代謝、尼古丁型乙酰膽堿受體（Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）表達(dá)及絲裂體活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路等的作用，了解其相互作用關(guān)系，探討他汀類藥物非膽固醇依賴性神經(jīng)保護(hù)的分子作用機(jī)制。
　　方法:選擇原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞及過表達(dá)APP670/671的SH-SY5Y細(xì)胞，用洛伐他汀、Aβ、OK

3、A、氟化物、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal regulated protein kinases,ERK）抑制劑、α7 nAChR受體拮抗劑等分別或合并處理培養(yǎng)細(xì)胞24-48小時(shí)。采用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活率；用生物化學(xué)方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性、及丙二醛（Methane dicarboxylic aldehyde,MDA）含量；

4、用蛋白印跡法（Western blotting）檢測(cè)細(xì)胞中nAChR?7、?4、?3、β2等亞單位蛋白表達(dá)水平，APP代謝途徑中α分泌型淀粉樣前體蛋白（α-Form of secreted APP，αAPP）、β分泌型淀粉樣前體蛋白（βAPP）、β淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-Site amyloid precursor protein-cleaving enzyme1，BACE1）、β淀粉樣前體蛋白裂解酶2（BACE2）及解聚素金屬蛋白

5、酶結(jié)構(gòu)域蛋白10（Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10，ADAM10）等的蛋白表達(dá)水平，ERK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）及p38磷酸化及總蛋白表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）測(cè)定nAChR亞單位的mRNA表達(dá)水平；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。所獲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.

6、0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用單（或多）因素方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
　　結(jié)果：
　?。?）細(xì)胞模型：結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞純度約達(dá)到85％，過表達(dá)APP670/671的SH-SY5Y細(xì)胞中APP的蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯高于野生型細(xì)胞；用0.1μM的洛伐他汀處理，未觀察到細(xì)胞毒性作用，膽固醇水平亦未見明顯改變，故選擇該濃度處理細(xì)胞。
　?。?）洛伐他汀的抗神經(jīng)毒性作用：用0.5μM Aβ寡聚

7、體（β-Amyloid peptide oligomers，AβOs）、20nM OKA、及20mg/L氟處理神經(jīng)細(xì)胞48h，可分別引起細(xì)胞存活率下降、SOD的活性降低和MDA的含量增高等毒性作用；0.1μM洛伐他汀預(yù)處理24h，能分別減輕A?Os、OKA及氟化物等引起的細(xì)胞毒性作用；
　?。?）洛伐他汀對(duì)nAChRs的作用：0.1μM洛伐他汀24h預(yù)處理能使α7 nAChR蛋白及mRNA表達(dá)水平升高，而α4、α3和?2未見明顯改

8、變。
　?。?）洛伐他汀對(duì)APP代謝的作用：0.1μM洛伐他汀24h預(yù)處理能使αAPP的分泌增加、βAPP的分泌減少、BACE1蛋白表達(dá)水平降低、而BACE2和ADAM10的蛋白表達(dá)水平增高。
　?。?）洛伐他汀對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用：0.1μM洛伐他汀24h預(yù)處理可使phospho-ERK1/2蛋白表達(dá)水平升高，而ERK1/2、JNK和p38總蛋白表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，phospho-JNK和phospho-p38

9、蛋白表達(dá)水平亦未見明顯改變。
　?。?）洛伐他汀、ERK、α7 nAChR及αAPP的相互關(guān)系：聯(lián)合應(yīng)用洛伐他汀與ERK1/2抑制劑U0126或α7 nAChR拮抗劑MLA處理神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果顯示，U0126處理神經(jīng)細(xì)胞，可以抑制phospho-ERK1/2的磷酸化，降低α7 nAChR蛋白表達(dá)水平，減少αAPP的分泌；同時(shí)，U0126可以阻斷洛伐他汀引起的MAPK/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化、α7 nAChR蛋白表達(dá)水平升高以及

10、αAPP分泌增加等作用。MLA處理神經(jīng)細(xì)胞，僅能減少αAPP的分泌，對(duì)其自身的蛋白表達(dá)及phospho-ERK1/2的磷酸化均無明顯影響；而MLA與洛伐他汀共同處理細(xì)胞，僅可見到洛伐他汀誘導(dǎo)的αAPP分泌增加作用被減弱，而MAPK/ERK1/2的活化以及α7 nAChR蛋白表達(dá)水平的上調(diào)均未被減弱。
　　結(jié)論：
　　（1）低濃度的洛伐他?。?.01及0.1μM）處理大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞及過表達(dá)APP670/671的SH-SY5Y

11、細(xì)胞，不產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性，亦不引起細(xì)胞膽固醇水平的改變。
　　（2）洛伐他汀能減少A?、OKA及氟化物誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡、SOD的活性降低和MDA的水平增高；
　?。?）洛伐他汀可引起MAPK/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化、α7 nAChR蛋白表達(dá)水平升高以及αAPP分泌增加，其作用機(jī)制可能為，首先活化phosphor-ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路的活化刺激α7 nAChR的表達(dá)，最終增強(qiáng)APP的非淀粉樣代謝過程，活化α