pAdtrack-cmv-rHSG重組穿梭質粒載體的構建、序列分析及rHSG生物信息分析.pdf

1、目的：(1)在前期構建pExpress-1-Rhsg重組質粒載體基礎上，構建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,Rhsg)pAdtrack-cmv-Rhsg重組穿梭質粒并鑒定，為進一步構建腺病毒載體及腦血管痙攣的基因治療提供物質基礎。
　　 (2)對測序報告結果中Rhsg基因序列進行序列與結構相關的生物信息分析,為認識該基因結構與功能提供借鑒。
　　 方法：
　　 (

2、1)目的基因的提取：復蘇本室保存的含pExpress-1-Rhsg質粒的Jm109菌，用質粒抽取試劑盒抽取質粒pExpress-1-Rhsg，并在PCR儀中擴增出目的基因Rhsg Cdna。
　　 (2)穿梭質粒的構建及鑒定：①復蘇本室保存的含腺病毒穿梭質粒pAdtrack-cmv的DH5α菌種，用質粒抽取試劑盒抽取質粒pAdtrack-cmv；②將PCR后Rhsg Cdna連接到Pgm-T質粒上，構建重組質粒Pgm-T-Rhs

3、g，并對重組質粒進行限制性內切酶酶切鑒定；③將Pgm-T-Rhsg重組質粒在LB固體瓊脂培養(yǎng)基上轉化到大腸桿菌DH5α，提取Pgm-T-Rhsg質粒；④用BglⅡ、Eco RV對Pgm-T-Rhsg重組質粒進行雙酶切，提取目的基因并鑒定；⑤用BglⅡ和Eco RV雙酶切pAdtrack-cmv質粒得到線性化的pAdTrack-CMV 片斷，在T4DNA連接酶下與目的基因連接，構建出重組pAdtrack-cmv-Rhsg穿梭質粒，并對重組

4、穿梭質粒pAdtrack-cmv-Rhsg進行酶切鑒定；⑥將重組穿梭質粒送測序公司進行DNA序列分析。
　　 (3)Rhsg基因生物信息分析：根據(jù)測序報告結果中Rhsg基因序列，用生物信息學方法對其進行同源性、分子量、蛋白跨膜區(qū)、等電點、親疏水性、蛋白二級結構等項的分析和預測。
　　 結果：
　　 (1)從質粒pExpress-1-Rhsg中成功提取出了Rhsg Cdna基因。
　　 (2)重組pAdtr

5、ack-cmv-Rhsg穿梭質粒經BglⅡ和Eco RV雙酶切后，進一步將重組體進行基因測序分析，驗證了克隆的Rhsg Cdna序列與GenBank[AF036536]公布的Rhsg序列吻合。這一結果表明重組體pAdtrack-cmv-Rhsg中插入的目的基因是正向、單倍插入。
　　 (3)Rhsg生物信息分析結果顯示，Rhsg全長4151bp，編碼一757氨基酸殘基的蛋白，可能為一跨膜蛋白，經基因Genebank查詢發(fā)現(xiàn)與人H