合成生物學(xué)技術(shù)制備青蒿素前體的研究.pdf

1、目的:紫穗槐-4,11-二烯合酶是青蒿素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，紫穗槐-4,11-二烯是青蒿素生物合成的前體。檢測(cè)大腸桿菌中紫穗槐-4,11-二烯合酶的活性，確定能提高酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的酵母交配型。
　　方法:通過酶切，連接和轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體。采用 CaCl2法將大腸桿菌表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌；采用 LiOAc法將該載體導(dǎo)入不同交配型的釀酒酵母中，獲得含同一載體的不同交配型

2、釀酒酵母工程菌。用 SDS-PAGE和 Western blot檢測(cè)大腸桿菌工程菌誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)物通過 GC-MS確定紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量，從而確定能提高工程菌中青蒿素前體的交配型。
　　結(jié)果:
　　1、對(duì)紫穗槐-4,11-二烯合酶基因進(jìn)行功能鑒定，證明該基因能將 FPP轉(zhuǎn)化成紫穗槐-4,11-二烯，為今后利用該基因進(jìn)行青蒿素的合成生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2、ADS是一種倍半萜合酶，從含 A

3、DS的釀酒酵母工程菌中檢測(cè)到了包括紫穗槐-4,11-二烯在內(nèi)的十種產(chǎn)物，再一次確證了 ADS產(chǎn)物特異性不高的特點(diǎn)。
　　3、不同交配型酵母工程菌對(duì)紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量無顯著性影響。為采用不同交配型酵母工程菌進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，代謝途徑的優(yōu)化以及其他因素對(duì)工程菌產(chǎn)量影響等的研究提供了理論依據(jù)，加速青蒿素前體代謝工程的研究。
　　4、培養(yǎng)條件影響酵母工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。
　　5、構(gòu)建了酵母表達(dá)載體