青蒿素生物合成相關(guān)基因組織表達(dá)譜分析及超量表達(dá)ADS基因提高青蒿素含量的研究.pdf

1、青蒿素(Artemisinin)是從我國藥用植物黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)（又名青蒿）中提取的一種含有過氧橋鍵的新型倍半萜內(nèi)酯化合物，是治療腦型瘧疾和抗氯喹類瘧疾的特效藥物，是世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization,WHO）推薦的的治療惡性瘧疾的首選藥物。每年有數(shù)千萬劑的臨床需求，但是天然青蒿中青蒿素含量較低(0.01％～0.6％，DW)，大大限制了青蒿素的商業(yè)化的生產(chǎn)，單從野生青蒿中提取青蒿素遠(yuǎn)遠(yuǎn)

2、不能滿足市場的需求。化學(xué)合成因其成本高、副產(chǎn)物多，毒性大而很難用于工業(yè)生產(chǎn)。近年來，隨著青蒿素生物合成途徑的深入研究以及控制相關(guān)反應(yīng)的關(guān)鍵酶基因的克隆，利用遺傳工程定向改造青蒿素生物合成途徑成為提高青蒿素含量的有效手段之一。本研究分析了青蒿不同組織中青蒿素合成途徑中關(guān)鍵基因的相對表達(dá)量，篩選出與青蒿素生物合成密切相關(guān)的基因，構(gòu)建植物高效表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入青蒿中進(jìn)行超量表達(dá)，研究其對青蒿素生物合成的影響。
　　 本實驗采用qPC

3、R技術(shù)研究不同組織中青蒿素合成涉及到的7個功能基因，包括HMGR、DXR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR和DBR2的相對表達(dá)水平，同時檢測對應(yīng)組織中青蒿素含量，分析各個基因與青蒿素合成之間的關(guān)系。青蒿素生物合成上游途徑（MVA途徑和MEP途徑）涉及到的3個關(guān)鍵基因HMGR、DXR、FPS在花中的表達(dá)量最高;青蒿素生物合成特有途徑涉及到的4個基因ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2在根、莖、葉和花中均有表達(dá);ADS表達(dá)量在

4、葉中最高，其次為花，莖中表達(dá)量最低;CYP71AV1在花中表達(dá)量最高，在葉中最低;CPR的表達(dá)量在葉中最高;而DBR2在根、莖、葉和花中的表達(dá)量相對而言都較低。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HighPerformanceLiquidChromatographywithEvaporativeLightScatteringDetector,HPLC-ELSD）測定各個組織中青蒿素的含量，結(jié)果顯示葉片中的青蒿素含量最高(0.34±0.077mg·

5、g-1DW)，花次之(0.15±0.017mg·g-1DW)，根(0.06±0.0026mg·g-1DW)和莖(0.06±0.0024mg·g-1DW)中含量較低。青蒿素生物合成中，上游途徑中的3個基因在花中的代謝更加活躍。在青蒿素生物合成下游途徑的4個功能基因中，ADS在各組織中的表達(dá)量與青蒿素含量完全一致，表現(xiàn)為正相關(guān)，表明ADS在青蒿素合成中起到重要作用，推測ADS可能是該途徑遺傳改造的重要靶點。
　　 根據(jù)根、莖、葉和花

6、各個組織中7個基因的表達(dá)譜研究，發(fā)現(xiàn)ADS基因相對表達(dá)量與各個組織中青蒿素的含量呈正相關(guān)。本研究利用超量表達(dá)策略構(gòu)建了高效植物表達(dá)載體p1304-ADS，并將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得了工程菌LBA4404-p1304-ADS。用根癌農(nóng)桿菌感染青蒿葉片，將ADS基因?qū)肭噍锍勘磉_(dá);并以潮霉素(10mg·L-1)進(jìn)行抗性篩選獲得抗性芽，待抗性長至2-3cm將其轉(zhuǎn)至MS+NAA(0.05mg·L-1)+Cef(200mg·L-

7、1)培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選并誘導(dǎo)生根，多次繼代培養(yǎng)。農(nóng)桿菌除菌完全后對抗性植株進(jìn)行基因組PCR檢測，在轉(zhuǎn)基因青蒿中能跨35S啟動子夠檢測到ADS(636bp)，而非轉(zhuǎn)基因青蒿中不能檢測到ADS。對檢測的陽性植株在MS+NAA(0.05mg·L-1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng);待植株長到5cm時轉(zhuǎn)到品氏托普育苗培養(yǎng)基中煉苗。4月中旬下地進(jìn)行田間實驗，現(xiàn)第一花蕾時對種植的青蒿進(jìn)行取樣，并以同期種植的非轉(zhuǎn)基因青蒿作為對照，石油醚萃取法提取青蒿素，HP

8、LC-ELSD法測定青蒿素含量。獲得的5個獨立轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)ADS基因青蒿進(jìn)行青蒿素含量測定，以非轉(zhuǎn)基因青蒿為對照。檢測結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量為0.96mg·g-1(DW)，在轉(zhuǎn)ADS基因黃花中有3個株系(A41、A48、A32)的青蒿素的含量有明顯的提高，而且與對照組相比其差異性達(dá)到了顯著水平(p＜0.01)，A164株系青蒿素含量與對照相比有小幅的降低，A26株系青蒿素并沒有顯著的提高。所獲得的5個株系中青蒿素的含量高低順序為

9、A32＞A48＞A41＞A26＞CK＞A164。164、A26、A41、A48和A32這5個轉(zhuǎn)基因株系中青蒿素干重含量分別為0.73±0.003mg·g-1、1.13±0.080mg·g-1、2.16±0.285mg·g-1、2.56±0.100mg·g-1、2.67±0.285mg·g-1，其中A32青蒿素含量最高為2.67mg·g-1，是非轉(zhuǎn)基因青蒿的2.7倍。在青蒿中超量表達(dá)內(nèi)源基因ADS能提青蒿素含量。通過該轉(zhuǎn)基因方法獲得的轉(zhuǎn)基