過表達(dá)ads和hdr基因?qū)η噍锼厣锖铣傻挠绊?pdf

1、青蒿素(artemisinin)是從一年生草本植物黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)中分離提取的一種含有過氧橋基團(tuán)結(jié)構(gòu)的新型倍半萜內(nèi)酯，它是治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的特效藥物。青蒿素聯(lián)合療法(Artemisinin Combination Therapies，ACTs)，已成為世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的治療瘧疾的首選方法。青蒿素除具有抗瘧作用外，還具有抗孕、抗纖維化、抗血

2、吸蟲、抗弓形蟲、抗心律失常和腫瘤細(xì)胞毒性等作用。青蒿素及其衍生物作為新型抗瘧藥，具有高效、快速、低毒、安全等特點(diǎn)。但是青蒿素在野生黃花蒿中含量極低，遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。化學(xué)合成青蒿素，產(chǎn)率低、成本高、毒性大也不適用于生產(chǎn)。近年來，隨著青蒿素生物合成途徑分子生物學(xué)研究的深入，為利用遺傳工程技術(shù)提高黃花蒿中青蒿素及其他倍半萜的含量奠定了基礎(chǔ)。
　　 羥甲基丁烯基-4-磷酸還原酶是位于質(zhì)體中2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑（或

3、非甲羥戊酸途徑）(2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphatepathway(ornon-mevalonatepathway)，MEP)上最后一個關(guān)鍵酶，催化羥甲基丁烯基-4-磷酸(hydroxymethylbutenyl-4-diphosphate，HMBPP)轉(zhuǎn)化為異戊烯基焦磷酸(isopentenyldiphosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate，D

4、MAPP)(5∶1)的混合物。羥甲基丁烯基-4-磷酸還原酶基因(hdr)的表達(dá)情況與植物次生代謝產(chǎn)物的合成有著重要的聯(lián)系。紫穗槐二烯合成酶催化法呢基焦磷酸(farnesyldiphosphate，F(xiàn)PP)環(huán)化為紫穗槐二烯，是青蒿素生物合成下游途徑的第一個限速步驟。過表達(dá)紫穗槐二烯合成酶基因(ads)能夠充分利用青蒿素生物合成上游途徑的底物，使更多的中間代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)化為目的終產(chǎn)物青蒿素。
　　 本研究以黃花蒿為材料，以羥甲基丁烯基-

5、4-磷酸還原酶(hydroxymethylbutenyl4-diphosphatereductase，HDR)基因和紫穗槐二烯合成酶(amorpha-4，11-diensynthase，ADS)基因?yàn)檠芯堪悬c(diǎn)，克隆黃花蒿hdr和ads基因的編碼區(qū)，構(gòu)建高效植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+-ads-hdr，并將該載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得工程菌LBA4404-pCAMBIA1304+-ads-hdr。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化，采

6、用葉盤法將hdr和ads基因?qū)朦S花蒿，潮霉素篩選獲得黃花蒿抗性芽，30d左右待抗性芽長至2-3cm將其轉(zhuǎn)至MS+0.05mg·L-1NAA+Cab250mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。經(jīng)多次繼代后對抗性植株進(jìn)行基因組PCR檢測。同時檢測vir基因片段、hygr抗性基因片段、目的基因ads和hdr片段（攜帶有部分CaMV35S啟動子序列）并與陽性對照和陰性對照進(jìn)行對比。最終從72株具有潮霉素抗性的黃花蒿植株中篩選出6個雙基因共轉(zhuǎn)化黃花

7、蒿植株克隆系，其編號依次為ah3、ah11、ah20、ah27、ah28、ah70。
　　 對檢測為陽性的植株在MS+1.00mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行快繁，再誘導(dǎo)生根，隨后進(jìn)行煉苗移栽。8月中下旬對種植的轉(zhuǎn)基因黃花蒿進(jìn)行取樣，并以同期種植的非轉(zhuǎn)基因野生型黃花蒿為對照，采用石油醚和甲醇等有機(jī)溶劑超聲輔助提取青蒿素，用HPLC-ELSD法進(jìn)行青蒿素含量測定。結(jié)果顯示，不同轉(zhuǎn)基因黃花蒿株系中青蒿

8、素含量差異較大,ah70、ah11、ah3、ah20、ah27、ah28株系青蒿素含量分別為0.53mg·g-1DW、0.51mg·g-1DW、0.27mg·g-1DW、0.46mg·g-1DW、0.39mg·g-1DW、0.47mg·g-1DW，與非轉(zhuǎn)基因株系青蒿素含量0.15mg·g-1DW相比都有不同程度的提高。青蒿素含量最高的ah70株系為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.48倍。同時田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ah3、ah20和ah70這3個轉(zhuǎn)基因株系的長

9、勢異于野生型對照和其他轉(zhuǎn)基因株系，其表現(xiàn)為植株矮小，易伏倒，較早的表現(xiàn)出衰老跡象。對收集的轉(zhuǎn)基因和野生型材料進(jìn)行hdr和ads基因的表達(dá)量分析，其結(jié)果與青蒿索含量基本一致，其表達(dá)量都相對于野生型有不同程度的提高。由于轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)，拷貝數(shù)不同等原因，使得hdr和ads基因表達(dá)量與青蒿素含量之間并沒有呈現(xiàn)絕對的對應(yīng)關(guān)系。hdr和ads基因表達(dá)量都相對較高的ah27株系其青蒿素含量并不是最高的，反而是ah70株系的青蒿素含量最高，這也可能與

10、ah70株系本身異于野生型植株的長勢有關(guān)。但總體上，雙基因策略在青蒿素的合成調(diào)控中起著重要的作用，6個轉(zhuǎn)基因株系在青蒿素含量和hdr和ads基因的表達(dá)量上都相對于野生型對照有所提高。說明雙基因的遺傳轉(zhuǎn)化能夠在一定程度上打破青蒿素生物合成途徑中的限速反應(yīng)步驟，推動代謝流更多的向目的產(chǎn)物青蒿素合成方向流動，提高青蒿素的合成能力，最終表現(xiàn)為青蒿素含量提高。
　　 hdr和ads基因分別是青蒿素上游MEP途徑中的最后一個關(guān)鍵酶基因和下游